[发明专利]一种高效表达谷氨酰胺转胺酶的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种高效表达谷氨酰胺转胺酶的基因工程菌，其特征在于，其表达的吸水链霉菌CCTCC M203062谷氨酰胺转胺酶酶原酶原区基因与成熟酶区基因之间引入酵母内源Kex2蛋白酶的切割位点Lys-Arg，所述酶原使用表达载体在解脂耶氏酵母中进行表达。

2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原根据Genebank：EU477523合成。

3.根据权利要求1或2所述基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pINA1297。

4.应用权利要求1所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征在于，通过PCR方法在吸水链霉菌CCTCC M203062谷氨酰胺转胺酶酶原酶原区基因与成熟酶区基因之间引入酵母内源Kex2蛋白酶的切割位点Lys-Arg，改造后的酶原使用表达载体在解脂耶氏酵母中进行表达。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）通过化学全合成获得谷氨酰胺转胺酶酶原基因片段；

2）将回收的谷氨酰胺转胺酶酶原基因片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒pINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，获得质粒pINA1297-proTG；

3）根据质粒pINA1297-proTG基因序列设计引入切割位点Lys-Arg，对应核苷酸序列为AAGCGA的PCR突变引物Kex1和Kex2；将改造的谷氨酰胺转胺酶酶原基因片段重新克隆到pINA1297获得pINA1297-proKexTG；

4）将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proKexTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母得到重组菌；

5）利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述突变引物Kex1和Kex2为：

Kex1：5’-CGAGACGCTGCCGACGAGAGGG-3’，划线部分为引入碱基序列；

Kex2：5’-CTTGGGGGCCCGGAAGAGCG-3’，划线部分为引入碱基序列。