[发明专利]一种甘蓝枯萎病菌的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，具体是一种甘蓝枯萎病菌的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

现在公知的甘蓝枯萎病菌就是尖孢镰刀菌粘团专化型，尖孢镰刀菌粘团专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Conglutinans)引起的甘蓝枯萎病是一种毁灭性的土传病害，在全球大部分甘蓝产区均有发生，该病自2001年在我国首次报道发生以来，先后在河北省张家口市、山西省晋中市和山西省大同市均有发生，在我国的发生呈蔓延趋势，并逐年加重，已成为影响我国甘蓝品质和产量的重要病害。甘蓝枯萎病是一种土传病害，病原菌可在土壤和病残体中越冬形成侵染循环，而且其侵染能力强，在较短时间内可造成植株死亡，且该病可能从发病区向未发病区传播。目前还很少有经济有效的防治甘蓝枯萎病的手段。因此，开展甘蓝枯萎病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对甘蓝枯萎病的传播与控制具有重要意义。

尖孢镰刀菌的检测技术一直是各国研究人员的研究热点，传统的检测方法是采用选择性培养基从发病土壤或植物组织中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，从而确定是否存在甘蓝枯萎病菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由甘蓝枯萎病菌引起的病害。传统的检测方法不仅耗时费力，而且要求检测人员具有极其丰富的形态学和分类学知识，最重要的一点是传统检测方法不能满足病害防治中指定最佳防治时期以及对病原菌快速检测和鉴定的要求，因此传统的检测方法已经不能满足甘蓝生产以及现代植物病理学研究的需要。

一般来说，分子检测手段比传统检测方法速度更快更具有特异性，而且更加灵敏和准确并且对操作人员的形态学知识要求不高。目前，包括RFLP、RAPD、RFLP和SCAR等基于DNA或RNA的分子标记方法已经在尖孢镰刀菌专化型的鉴检测中得到了应用。然而由于这些分子标记可以在基因组上被任意定位，公共数据库中可以用来和其他序列比较的数据比较少，可靠而稳定的标记还需要通过更多数量的菌株去进一步筛选。因此，在病原菌全基因组测序数据的基础上设计高特异引物对其进行检测是非常必要的。

发明内容

为解决上述检测甘蓝枯萎病菌的在技术存在的缺陷，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌分子检测试剂及其检测试剂盒，其目的是针对现有技术中甘蓝枯萎病菌的生物学检测方法所需周期长，且目前尚未有甘蓝枯萎病菌分子检测方法的问题，通过对甘蓝枯萎病菌进行全基因组测序，并通过比较基因组学的方法找出甘蓝枯萎病菌特异于其他枯萎病菌的基因组片段，然后这针对甘蓝枯萎病菌的特异片段碱基序列设计出了一对高特异引物，用于带甘蓝枯萎病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，并提供一种准确性高、操作简便、特异性强且灵敏度高的甘蓝枯萎病菌快速分子检测的试剂盒，该试剂盒可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于甘蓝枯萎病菌引起病害显症之前的早期检测和诊断具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌的检测试剂盒，该试剂盒包括，浓度均为10pmol/μl的检测上游引物Foc-R、下游引物Foc-S各1μl，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的Taq聚合酶0.4μl、1μl的甘蓝枯萎病菌阳性对照DNA、重量浓度≥99％的超纯水20ul。检测引物的序列：

Foc-R的序列5′-TCAATGATAGTGACAAGGGTTT-3′、

Foc-S的序列5′-AATTTGCTGTGATAGGTGGAT-3′

本发明还公开了采用所述试剂盒检测甘蓝枯萎病菌的方法，该方法包括如下步骤，(1)利用CTAB法提取被甘蓝枯萎病菌感染的植物组织DNA、或利用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒方法提取被甘蓝枯萎病菌侵染的土壤DNA；

(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增；

(3)将6μl步骤(2)的PCR扩增产物用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果，当特异性地扩增出436bp产物时，即可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌。

所述步骤(1)利用CTAB法提取被甘蓝枯萎病菌感染的植物组织DNA时，其具体操作方法为，①取50mg冷冻干燥后的甘蓝枯萎病菌菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μL的CTAB提取液和90μl质量浓度10％十二烷基本磺酸钠后振荡混匀；