[发明专利]一种核壳型分子印迹纳米材料的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种核壳型分子印迹纳米硅球的制备方法，其特征在于步骤如下：

1）双键化的纳米硅球的合成

将四乙氧基硅烷加入乙醇、水和25w%氨水的混合溶剂a中，18-25℃下搅拌24小时，将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷加入上述溶液中，18-25℃下搅拌48小时，将所得溶液在10,000 rpm 转数下离心10min，收集产物，用乙醇重悬洗涤3次，将离心后产物置于真空干燥箱中室温下干燥48小时，得到双键化的纳米硅球，将该纳米硅球超声分散到体积比为1:1的乙醇和0.02M、PH 7.3磷酸钠缓冲液的混合液中，得到双键化纳米硅球的胶体溶液；

2）辅助识别聚合物链（ARPCs）的合成

将4-乙烯基吡啶和丙烯腈依次加入无水乙醇中，搅拌下加入偶氮二异丁腈，氮气保护下80℃聚合反应8小时，将以上溶液倒入无水乙醇中，抽滤得到沉淀固体并将沉淀固体用乙醇洗涤2-3次，然后在18-25℃、真空度为0.015MPa下干燥得到聚乙烯基吡啶-丙烯腈的无规共聚物（PANVP）；将PANVP在85w%的硫酸溶液中100℃下水解4小时得到聚乙烯基吡啶-丙烯酸的无规共聚物（PAAVP），将PAAVP在无水乙醇-水的混合溶剂b中沉淀出来并用混合溶剂b洗涤2-3次，然后18-25℃、真空度为0.015MPa以下干燥24小时；再将PAAVP、 N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、烯丙醇与二甲基亚砜溶剂混合，30℃下搅拌48小时，将产物在无水乙醇中沉淀并用无水乙醇洗涤2-3次，最后在18-25℃、真空度为0.015MPa下干燥，得到辅助识别聚合物链（ARPCs）；

3）蛋白质印迹聚合物纳米硅球的制备

将ARPCs加入含有克隆的免疫球蛋白重链结合蛋白质（BiP）、PH为7.3、20mM磷酸钠缓冲液中，4℃下自组装8小时；将所得自组装体溶液与1）所得双键化纳米硅球的胶体溶液混合， 4℃下自组装7小时得到反应液a；然后在反应液a中加入浓度为30w%的丙烯酰胺溶液和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的混合液b，在18-25℃，抽真空至0.015Mpa以下后通氮气，反复三次除氧后并搅拌1小时，得到反应液b，在反应液b中加入浓度为10w%的过二硫酸铵溶液和N,N,N',N'-四甲基二乙胺，18-25℃下交联反应24小时，在10，000转/分下离心10分钟，收集沉淀，用0.02M、PH7.3的磷酸盐缓冲液反复洗涤2-3次；最后用含0.5M氯化钾、PH7.3、20mM的磷酸钠缓冲液洗脱所得纳米硅球至电泳检测无BiP蛋白质条带，将所得产物冻干，即可得到核壳型的蛋白质印迹纳米硅球。

2.根据权利要求1所述核壳型分子印迹纳米硅球的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂a中乙醇、水和25w%氨水体积比为5:5:1；四乙氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与混合溶剂a的体积比为9: 1: 33。

3.根据权利要求1所述核壳型分子印迹纳米硅球的制备方法，其特征在于：所述4-乙烯基吡啶、丙烯腈与无水乙醇的体积比为1:60:400；4-乙烯基吡啶与偶氮二异丁腈的用量比为1mL:4.6g；PANVP与85w%的硫酸溶液的用量比为1g:7.5mL；混合溶剂b中无水乙醇与水的体积比为1:1，PANVP与混合溶剂b的用量比为1g:60mL；PAAVP、 N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、烯丙醇与二甲基亚砜溶剂的用量比为1g:0.88mL: 1.135g:0.57mL:25mL。

4.根据权利要求1所述核壳型分子印迹纳米硅球的制备方法，其特征在于：所述克隆蛋白质BiP与20mM磷酸钠缓冲液的用量比为1mg:0.96mL，BiP 与ARPCs与的摩尔比为1:145， BiP与纳米硅球质量比为1:4.8；混合液b中丙烯酰胺溶液和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为29:1，混合液b与反应液a的体积比为1:50；反应液b与10w%过二硫酸铵溶液和N,N,N',N'-四甲基二乙胺的体积比为12240:80:1。

5.一种权利要求1所制备的核壳型分子印迹纳米硅球的应用，其特征在于：用于细胞提取液中天然微量蛋白质的富集和提纯，包括下述步骤：

1）4℃下，将制备的蛋白质印迹纳米硅球直接放入猪肝细胞提取物中吸附20小时，蛋白质印迹纳米硅球与猪肝细胞提取物的用量比为1mg:180μL；

2）将吸附蛋白后的蛋白质印迹纳米硅球依次用PH为7.3、含0.02M磷酸钠缓冲液洗涤6次、含0.10M氯化钾的磷酸钠缓冲液洗涤2次、含0.30M氯化钾磷酸钠缓冲液洗涤2次和含0.50M氯化钾磷酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤液用量均为1.8mL，收集全部洗涤液；

3）用三氯乙酸-脱氧胆酸钠方法沉淀上述洗涤液中的蛋白，蛋白液上样后，恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染和免疫印迹法检测洗脱液中BiP含量，用BCA方法检测洗脱液中总蛋白含量，从而得出BiP在总蛋白中所占的比例。