[发明专利]中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属水产种质检测领域，涉及中华鳖四种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒，具体涉及一种中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系新品种种质鉴定的快速检测方法及其引物组及试剂盒。

背景技术

中华鳖（Pelodiscus sinensis）,俗称团鱼、甲鱼等，隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，广泛分布于我国各地，现已发展成为我国重要的名特水产养殖品种。据统计，2012年全国中华鳖养殖产量达33余万吨，产值逾200亿元，苗种放养量约10亿只，其中一半以上的苗种依赖境外输入。目前我国中华鳖养殖的种类主要包括中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系等，不同种群的中华鳖生长速度差异较大，鳖苗市场价格也变化较大。如2012年中华鳖太湖种群和黄河种群的鳖苗价格2~3元/只，台湾种群的鳖苗售价1~2元/只，中华鳖日本品系苗价4~6元/只。为满足养殖生产需要，各地加大了中华鳖的引种与扩繁，伴随而来的是中华鳖种质的混杂，严重影响中华鳖种质资源保护工作。同时，因优质鳖苗市场价格高，利润大，市场上出现了一些不法商贩以劣质鳖苗冒充中华鳖日本品系等优质鳖苗来谋取非法暴利的现象，给养鳖者造成重大的经济损失。因此，准确鉴别中华鳖的种质来源，已成为我国中华鳖种质资源保护与育种研究的首要工作之一。

根据现行中华鳖种质标准GB21044-2007要求，主要采用外部形态、内部构造、生化同工酶、染色体核型等方法进行种质鉴定，但该标准无法对不同种群的中华鳖进行区别鉴定。常规检测中华鳖不同种群的鉴别方法有形态标记鉴别、同工酶标记鉴别和mtDNA线粒体序列鉴别法等，但外部形态标记鉴别法受中华鳖养殖环境影响较大，容易出现误判；同工酶标记具有组织特异性和个体差异，并且受到个体发育阶段的影响，因而无法达到较高的准确度要求；RAPD方法重复性差、且对模板要求高，因而鉴定结果的可靠性也受到限制；mtDNA线粒体序列鉴别法尽管准确，但需要借助大型测序仪来完成，大多实验室往往因仪器价格昂贵而没能采购，从而只能将扩增好的样品外送测序后再进行种质鉴别，时效性不能保证。经国内外文献查询，尚未见有稳定、可靠、简便的中华鳖四种不同种群种质鉴别的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测引物，它们是3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6：

SEQ No.1：5’-GAACCCCTATCACGAAAACG-3’，浓度为10pM；

SEQ No.2：5’-TACAATATTACTCACAGACCGAAAC-3’，浓度为10pM；

SEQ No.3：5’-ATAGGACAACCACGATTTCAGC-3’，浓度为10pM；

SEQ No.4：5’-GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG-3’，浓度为10pM；

SEQ No.5：5’-TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT-3’，浓度为10pM；

SEQ No.6：5’-TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC-3’，浓度为10pM。

本发明的另一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测试剂盒。

所述的试剂盒组成包括pH值为 8.3的2×Taq PCR 预混液、浓度为5U/μl的限制性内切酶Bgl I及对应的10×酶切缓冲液A、浓度为5U/μl的限制性内切酶Hpa II及对应的10×酶切缓冲液B、浓度为5U/μl的限制性内切酶Cla I及对应的10×酶切缓冲液C、浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白BSA、4种已知来源中华鳖的对照DNA模板和浓度为10pM的3对扩增引物。

所述的2×Taq PCR 预混液为0.1U/μl Taq酶、500uM dNTP、2×PCR缓冲液的混合液；

所述10×酶切缓冲液A为1M 、500mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.9；

所述10×酶切缓冲液B为100mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.0；

所述10×酶切缓冲液C为500mM 、200mM 、100mM 、10mM 的混合液。

本发明的又一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测方法。

步骤(1).总DNA的提取：