[发明专利]一种生产7-脱氢胆甾醇的酿酒酵母菌株及构建方法

权利要求书

1.一种固醇C-24还原酶基因，其特征是它是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列。

2.权利要求1的一种固醇C-24还原酶基因编码的蛋白质，其特征是所述蛋白质是序列表SEQ ID NO:10所述的氨基酸序列。

3.一种包含固醇C-24还原酶基因的生产7-脱氢胆甾醇的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)载体的构建

载体SyBE_000923的构建：

①将酵母组成型启动子、tHMGR基因、终止子应用限制性内切酶方法拼接起来，得到两端包含XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点的片段，连接至整合型载体pRS403、pRS405、pRS304或pRS305中；

②将酵母组成型启动子、ERG1基因、终止子应用限制性内切酶方法拼接起来，得到两端包含ApaⅠ和SalⅠ两个位点的片段，连接至步骤①获得的载体，得到载体SyBE_000923；

所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列；所述ERG1基因是序列表SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列；

载体SyBE_000937的构建：

将酵母组成型启动子、SEQ ID NO:9所示固醇C-24还原酶基因、终止子采用限制性内切酶方法拼接起来，得到两端包含HindⅢ和BamHⅠ位点的片段，连接入游离型载体pYES2、pRS423或pRS425中，得到载体SyBE_000937；

(2)酵母菌株SyBE_000954的获得

以SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示序列为上下游引物，酵母选择标记基因LEU为模板，通过PCR扩增技术将内源基因ERG5序列前后的同源臂引入LEU基因，PCR产物转化酿酒酵母菌株YML008C或W303a，得到改造后的酵母菌株SyBE_000954；所述酵母菌株YML008C为酿酒酵母BY4742的ERG6基因单敲菌株；

所述LEU基因是序列表SEQ ID NO:13所述的核苷酸序列；

(3)将所述载体SyBE_000923、SyBE_000937导入到酿酒酵母SyBE_000954中，得到生产7-脱氢胆甾醇的酿酒酵母菌株。

4.权利要求3的一种生产7-脱氢胆甾醇的酵母菌的构建方法构建的酿酒酵母菌株。

5.根据权利要求3所述的一种生产7-脱氢胆甾醇的酵母菌的构建方法，其特征是所述酵母组成型启动子为TDH3p、PGK1p或TDH1p。

6.根据权利要求3所述的一种生产7-脱氢胆甾醇的酵母菌的构建方法，其特征是所述终止子为PGK1t或CYC1t。