[发明专利]一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法。

背景技术

莫勒菌（Moelleriella ochracea）是粉虱的重要病原真菌，因此其经常被用于粉虱的生物防控，而且取得了显著效果。近年来，人们把目光转移到其代谢产物上来，已分离到一些有生物活性的物质，如具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性的化合物。

麦角固醇是一种重要的医药化学原料，可用于考的松和激素黄体酮等药物和农药的使用，它还是维生素D的前体，可用于保健类食品及药品添加，具有进一步研究开发的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，以促进其进一步在医药和食品中的开发，为人类造福。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从莫勒菌中提取麦角固醇的方法，包括以下步骤：

1）取保存于实验室的莫勒菌菌株（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）（体积分数为25%的甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃下培养一周时间。

2）待莫勒菌活化后，160~200 r/min、23~28℃条件下连续培养8~12 d即初级培养，按8％~10％接种量转接到M102培养基中，继续在160~200 r/min、23~28℃下连续培养25~30 d即次级培养。

3）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用2~4倍甲醇浸泡1~3天，超声40~60 min，旋蒸得菌丝体浸膏。

4）将菌丝体浸膏用尽可能少的氯仿溶解（可适当超声，以促进其溶解），然后用硅胶进行拌样。上硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯体积比为30: 1梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5: 1部位洗脱液，旋蒸浓缩。

5）将以上得到的化合物，用乙酸乙酯洗出，甲醇重结晶，得到白色粉末。

所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备为：200 g马铃薯，沸水煮30 min，经6层纱布过滤后加20 g葡萄糖，15g琼脂，加单蒸水定容至1L，121℃高压灭菌，20 min。

所述M102培养基的制备为：蔗糖30.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，溶于双蒸水定容至1 L，121℃高压灭菌，20 min。

所述步骤4）中拌样硅胶是160~200目的粗硅胶，进行梯度洗脱所用硅胶是200~300目细硅胶；进行梯度洗脱时，换洗脱液体系体积比为5个跨度：30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，5:1。

所述步骤5）中重结晶具体操作为：用乙酸乙酯将得到的含有少量杂质的麦角固醇溶解，自然挥干，待晶体析出后，再用甲醇洗去杂质，析出弃掉，剩余的晶体再用甲醇溶解后重结晶，直至获得单一的麦角固醇。

本发明的显著优点在于：

（1）莫勒菌繁殖快，取材方便；

（2）分离纯化简单，成本低；

（3）制得的化合物含量多，且纯度高。

附图说明

图1是化合物的TLC，化合物经薄层层析TLC、浓硫酸显色为紫红色，说明其为甾类物质。

图2是化合物的EI-MS谱，显示化合物的相对分子量为396。

图3是化合物的¹H NMR谱(CDCl₃)，表明该化合物存在6个甲基信号。

图4是化合物的¹³C NMR谱(CDCl₃)，显示该物质28个碳信号。

图5是化合物的 DEPT 135谱(CDCl₃)，表明化合物存在4个季碳、7个仲碳。

图6是化合物的平面结构。

具体实施方式

实施例1

1)取保存于实验室的莫勒菌菌株（25%甘油保存），在无菌条件下，用接种环取少量菌块在无菌水中清洗掉甘油，然后涂布于含马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，25℃条件下培养一周时间。