[发明专利]一种贴壁细胞的计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞实验中的细胞计数方法，具体地说是一种单层、贴壁生长的细胞的计数方法。

背景技术

确定细胞数量是细胞学研究及药物开发中经常遇到的问题。例如，测定某个抗肿瘤化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，即可用96孔培养板，通过化合物与肿瘤细胞孵育，然后测定对照孔与实验孔中的细胞数量反应化合物的活性。国际上常用同位素、BrdU标记等方法，通过检测细胞内核酸的量反应细胞的数量，但这两种方法不仅操作繁琐，而且价格昂贵。同时，同位素标记法还具有一定的放射性。因此，虽然国际上比较认可这两种方法，但国内应用较少。国内常用MTT等方法反应细胞数量，但该方法的原理是通过细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶把MTT转化为有色的formzan，用酶标仪等检测formzan的量反应细胞数量。但是，经过药物等处理后，不同组细胞内含有的线粒体数量不同，导致单位细胞转化MTT的能力不同。因此，MTT结果有时不能真实反应细胞的数量。

发明内容

为了克服同位素、BrdU标记等方法操作繁琐、成本高昂等不足，MTT等方法有时不能真实反应细胞数量的情况，本发明提供了一种操作简单、成本低廉的方法反应细胞数量。

本发明采用的技术步骤如下（以96孔板培养细胞为例）：

1、吸掉孔内培养基，用100μl乙醇固定10min

2、固定结束后，加入PBS稀释的DAPI 100μl至1μg/ml，对细胞核进行标记

3、5min后用倒置荧光显微镜拍照，以10倍物镜拍孔内的上、下、左、右、中五个视野

4、用图像分析软件对细胞核进行计数，以细胞核的数量反应细胞数

贴壁生长的细胞一般具有接触抑制的生长特性，即细胞密度过高时停止增殖。如果对整个细胞染色，然后用图像分析进行细胞计数，很难实现。因为细胞密度过高时，细胞连成片，染色也连成片，计算机无法识别细胞数量。但细胞核位于细胞浆中，不管细胞密度多高，不同的细胞核也不会连成片，即相互独立，这就为计算机识别细胞核提供了基础。对细胞核染色，成像后照片中是独立的细胞核，计算机很容易识别，对细胞计数。

另外，国内常用的MTT法，从加入MTT到获得各组之间相对细胞数量的结果，需要约4.5小时（MTT至少与细胞孵育4小时），而本方法只需约0.5小时即可获得数据，大大提高了实验效率。

附图说明

图1. PC-3细胞绝对细胞数量和相对细胞数量的拟合曲线

图2. MDA-MB-231细胞绝对细胞数量和相对细胞数量的拟合曲线

图3. 3AO细胞绝对细胞数量和相对细胞数量的拟合曲线

图4. 不同细胞明场成像、荧光成像及两者叠加的图片

图5. 阳性药Bestatin与化合物M03的化学结构

图6. 阳性药Bestatin与化合物M03对肺癌A549细胞的生长抑制率

具体实施方式 

实施例1：使用本发明所述方法对PC-3细胞进行计数

1、  将细胞铺于96孔板中，2500、5000、10000、20000/孔/200μl

2、  细胞贴壁后（约5h），吸掉孔内培养基，用100μl乙醇固定10min

3、  固定结束后，加入PBS稀释的DAPI 100μl至1μg/ml，对细胞核进行标记

4、  5min后用倒置荧光显微镜拍照，以10倍物镜拍孔内的上、下、左、右、中五个视野

5、  用图像分析软件对细胞核进行计数，以细胞核的数量反应细胞数

采用本发明所述方法对PC-3细胞进行计数，实际细胞数与相对细胞数之间相关性好（如图1所示），并且如图4所示，细胞核与细胞之间一一对应，细胞核的数量能反应细胞的数量。

实施例2：使用本发明所述方法对MDA-MB-231细胞进行计数

1、  将细胞铺于96孔板中，2500、5000、10000、20000/孔/200μl

2、  细胞贴壁后（约5h），吸掉孔内培养基，用100μl乙醇固定10min

3、  固定结束后，加入PBS稀释的DAPI 100μl至1μg/ml，对细胞核进行标记

4、  5min后用倒置荧光显微镜拍照，以10倍物镜拍孔内的上、下、左、右、中五个视野

5、  用图像分析软件对细胞核进行计数，以细胞核的数量反应细胞数