[发明专利]利用重组毕赤酵母生产蛋白A的方法

权利要求书

1.一种利用重组毕赤酵母生产蛋白A的方法，其特征是：通过分泌型表达质粒pPIC9K将蛋白A抗体结合功能区基因整合入毕赤酵母GS115基因组中，制备了可外泌表达蛋白A的重组毕赤酵母rGS115-spa，并筛选得到了高表达量的菌株；利用经过优化的BMGY/BMMY和BSM培养基，以甲醇为诱导剂的培养方法实现了重组蛋白A的高密度发酵分泌表达；并利用脱盐柱偶联离子交换层析柱的方法对所得的含有蛋白A的发酵液进行分离纯化，获得纯度接近色谱纯，后收率约为80%的蛋白A产物。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于， 

（1）重组毕赤酵母的构建及筛选方法：通过聚合酶链反应设计引物，上游引物（spa-a）：5’GCTGCAGAATTCGCGCAACACGATGAAG3’；下游引物（spa-b）：5’AGGTTTGTTGGCGGCCGCTTATTTTGGT3’，在蛋白A抗体结合功能区基因两端引入识别序列分别为为GAATTC和GCGGCCGC的EcoR I和Not I酶切位点，经双酶切后再连接插入pPIC9K中，构建成重组质粒pPIC9K-spa；重组质粒经制性内切酶Sac I将重组质粒线性化后，利用电击法转化感受态毕赤酵母GS115；转化后的克隆经RDB或MD平板筛选和菌液PCR验证，阳性克隆再经蛋白A表达量筛选，最终获得高表达量的重组菌株rGS115-spa； 

（2）重组毕赤酵母生产蛋白A的诱导培养和发酵 

利用（1）得到的重组酵母生产蛋白A的诱导培养方法：先利用BMGY培养基，在28℃-30℃，150-300rpm，pH6.0的条件下培养菌体至OD_600nm为2-6；再将菌体转移至5-20倍体积的BMMY培养基中，在22℃-30℃，150-300rpm，pH2.6-5.6的条件下，每24小时补加甲醇至终浓度0.5%-2%，继续培养96小时。 

3.利用所述的重组酵母生产蛋白A的发酵方法为：先利用YEPD培养基在30℃，150-300rpm，pH6.0的条件下培养菌体至OD_600nm为4-8后转接到BSM培养基中，在30℃，pH5.0的条件继续培养下培养至BSM培养基中甘油消耗完全；再向BSM培养基中进行甘油流加补料，继续培养至OD_600nm为300-350；待培养基中甘油消耗完全后换成甲醇流加补料，诱导表达120h。4、根据权利要求1或2所述的方法，利用所述的重组酵母生产蛋白A的纯化方法为：先利用脱盐柱去除发酵液中的色素和盐等小分子物质，再利用离子交换层析法对蛋白A进行精细分离纯化，使其最终纯度达色谱纯标准。