[发明专利]一种制备Ⅰ/Ⅱ胶原双层复合胶原膜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种I/II型双层复合胶原膜的制备方法，以及利用该方法制备的I/II型双层复合胶原膜。

背景技术

骨关节炎、运动损伤、剥脱性骨软骨炎等多种原因可导致关节软骨损伤。关节软骨自身没有血供、淋巴引流、神经分布，是高度分化的组织，成熟的软骨组织分裂能力非常有限，一旦损伤很难修复。因此如何解决关节软骨修复问题变得日益重要。目前常用的治疗方法有关节镜清理术、关节软骨钻孔折及自体或异体骨一软骨移植，但临床效果不够理想，均不能实现透明软骨修复。随着组织工程技术和材料与分子生物学的发展及应用于临床，人们在关节软骨损伤修复的实验研究方面取得了许多重大进步，尤其是基于细胞和材料组织工程技术的发展，为损伤关节软骨的修复重建提供了新的治疗方法。

在软骨修复组织工程技术领域，目前以生物支架为支持材料、自体或异体软骨细胞提供缺损的软骨细胞修复细胞基础。生物材料中提供细胞生长的胶原膜或支架需要具备三维孔洞结构和良好的机械性能，将有利于细胞进行必要的物质代谢。目前胶原膜的制备过程中，胶原膜的孔径和孔隙率是关键。研究显示软骨组织工程支架材料的孔径大小在90～120μm范围内，最适合于诱导软骨细胞生长。作为移植物除了要求应具备良好的组织相容性，还应该具有高度的多孔性，孔径至少应在50μm以上，孔隙率在70～90％^[1]，特别是广泛存在的大的交通孔有利于骨、软骨细胞和基质形成^[2]。

基质诱导的自体软骨细胞移植术(MACI Matrix-induced Autologolus Chondrocytes Implantation)，是用于修复由外伤或运动损伤等因素导致的关节软骨缺损。MACI技术是一种将自体软骨细胞扩增培养后，种植于纯化的、可吸收的I/III型猪衍生胶原膜上。该方法是目前国内、外报道的最先进的技术，并已经应用于临床治疗关节软骨损伤。该技术所用的复合胶原膜是基于I/III型胶原基础。

正常关节软骨细胞包绕在以II型胶原蛋白为主要成分的细胞外基质中，该细胞外基质中不含III型胶原。基于这一点考虑，本发明用II型胶原替代III型胶原。设计的复合双层胶原膜不仅包括了一般胶原膜的优点，同时也具有自身的特点：复合双层结构中，底层为高度致密、光滑、均匀的I型胶原膜，该层经过脱水后完全失去水分，镜下无孔径存在，起到防止细胞流失，为细胞在II型胶原膜中生长提供良好的环境，减少外界的干扰，缓解II型胶原膜降解时间；顶层为高浓度II型胶原膜层，表面呈白色、粗糙、海绵样结构，镜下孔径致密，分布较均匀，为软骨细胞提供良好的生长环境；I型、II型双层胶原膜之间经过化学交联，使它们结合紧密，坚固牢靠无空隙；双层复合的胶原膜延缓了降解时间，尤其是I型胶原膜层高度致密，本身具有较强抵抗胶原酶酶解作用。

发明内容

本发明目的在于利用高浓度的I型、II型胶原蛋白，制备I/II型双层复合胶原膜，使其在冻干后形成的三维孔径小、致密，更有利于软骨细胞的生长，为其提供更好的生长空间，促进细胞增殖传代。

本发明提供一种制备I/II胶原双层复合胶原膜的方法，包括：

(一)I型胶原膜的制备：

(1)将牛跟腱用超纯水清洗3次，修剪去除杂质，清洗，95％的乙醇浸泡组织10min，超纯水清洗5次；

(2)将步骤(1)的牛跟腱用组织剪捣碎，浸泡在0.05mol/L乙酸中10min；

(3)牛跟腱在乙酸中溶胀，成透明果冻状，匀浆，4℃操作；

(4)将步骤(3)的牛跟腱放入烧杯中，加入0.05mol/L乙酸和胃蛋白酶，4℃搅拌72h进行酶解；

(5)将步骤(4)的酶解液于15000r/m，30min离心，收集上清液，调整pH值至中性，4℃操作；

(6)将步骤(5)的溶液于12000r/m，30min离心，收集沉淀的胶原，超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h，然后冻干形成I型胶原，4℃冷藏备用；

(7)称取步骤(6)的I型胶原，溶于0.05mol/L乙酸，4℃搅拌24h，过滤胶原溶液，放入4℃医用冰箱静止24h，等待大量气泡挥发；

(8)将I型胶原溶液倒入培养皿中，放入超净台中脱水，形成I型胶原膜；

(二)II型胶原膜的制备：

(1)超净台中用手术刀剔取猪膝关节中透明的关节软骨，超纯水冲洗5次，95％的乙醇浸泡组织脱脂10min，超纯水冲洗5次；