[发明专利]一种富硒沼泽红假单胞菌制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的制备方法包括以下步骤：

  （1） 菌种活化：

   本发明采用沼泽红假单胞菌活菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM1.167，将-80℃保存的沼泽红假单胞菌活菌菌种在种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，琼脂粉15g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）试管斜面上划线，光照强度3000~5000lx，30℃培养96个小时左右；

   （2）制备一级种子：

将活化的沼泽红假单胞菌活菌，用接种环挑取一环接种于20mL种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）的试管中，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

   （3）制备二级种子：

经过优化后的沼泽红假单胞菌液体发酵培养基配方：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，经121℃、20min高温高压灭菌；在无色透明的细口瓶的液体培养基中，以10~35%的比例接入一级种子液，加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右（活菌数达到3×10⁹ CFU/mL 左右）；

（4）三级大瓶培养：

培养基：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水或冷开水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，培养基加入透明聚乙烯桶内（容量为5 L、10L、15L或者更大），装液量为40%左右，以10~35%的比例接入二级种子液，保持温度为30~35℃，pH 7.0-8.0，光照强度3000~10000

lx，从静置培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天后，培养液中硒的浓度下降为10 ug/mL左右，硒的转化率可达90%以上，菌体富硒量可达到75mg硒每克干菌种，有机硒含量为97%以上；将透明聚乙烯桶放在遮阳网下面进行培养，所有聚乙烯桶要避免阳光直晒，光照强度3000~10000lx，每天上午摇动聚乙烯桶一次，每次摇动10下，观察生长情况；在培养过程中，各聚乙烯桶内培养液的颜色变化均由淡黄、橙黄、浅红色到紫红色，所不同的是紫红色的显现时间；

（5）收集富硒沼泽红假单胞菌菌体并制剂：

将紫红色的发酵液经过低温离心后，收集菌体并加入保护剂进行冻干干燥或者65℃下加温处理60min以内，经过干燥和包装，制成可用于人类食品的富硒沼泽红假单胞菌制剂；

也可以将紫红色的发酵液用植物淀粉吸附并干燥制成畜禽饲料添加剂：以玉米粉、小麦粉或豆饼粉，或者其任意组合，作为紫红色发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，经过粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于所述的液体发酵培养基为：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，自来水或者冷开水进行配制。

3.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：培养温度为温度为30~35℃，pH 7.0~8.0。

4.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：各级种子菌接种量为10~35%的接种量。

5.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：所用的菌种为红假单胞菌属沼泽红假单胞菌种。

6.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：该沼泽红假单胞菌活菌制剂的应用领域为人类食品或者畜禽饲料添加剂。