[发明专利]一种能特异性结合BCG糖脂抗原的DNA 适配子及其应用

说明书

 

技术领域

本发明属于分子微生物学和感染免疫学领域，涉及一种能特异性结合BCG糖脂抗原的DNA 适配子及其应用。

背景技术

结核病（Tuberculosis, TB）是一种流行广、危害大的传染病，与艾滋病、疟疾并称为世界三大传染病。全球有三分之一的人感染过结核病，每年死于结核病者有170多万人，为防治TB耗去大量人力、物力。

目前，唯一获准用于预防结核病、并广泛使用的疫苗是卡介苗（BCG，bacillus Calmette- Gue′rin）。多年实践表明，BCG仅对儿童有一定保护作用，对成年人保护效果差异很大，其预防作用从0%～80%不等。这一传统疫苗的效果受到严峻挑战。BCG是减毒的牛分枝杆菌，可能仍保留部分免疫抑制因子，这就限制了它在免疫调节过程中的保护作用，因此改造免疫调节中所涉及的分子可能提高其免疫原性，使其免疫抑制作用减弱，成为一种真正安全有效的结核病新疫苗。

甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（Mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM）是存在于毒性结核分枝杆菌、BCG等细胞壁表面的主要成分，但由于其酰基化以及糖基化修饰的不同，不同菌种中ManLAM 的结构各异，是从结构上区分各种分枝杆菌的分子靶标。研究表明，ManLAM是毒性结核分枝杆菌H37Rv发挥免疫抑制作用的主要因素之一。结核分枝杆菌感染人体后，进入巨噬细胞吞噬体，其表面的ManLAM为磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）类似物，可竞争性结合某些蛋白，干扰或阻碍PI3P聚集。 PI3P表达受抑制以后，吞噬体成熟受抑制，吞噬体和溶酶体融合则受阻，结核分枝杆菌就可以逃避溶酶体的追杀，长期寄生于巨噬细胞。ManLAM还可利用其末端的甘露糖帽与树突状细胞（DCs）结合，介导H37Rv菌株对树突状细胞(Dendritic cell, DC)的感染并抑制DC的成熟。总之，ManLAM可能是结核分枝杆菌和BCG细菌细胞壁表面重要的免疫抑制因子。

SELEX （Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）筛选技术是90 年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的单链随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR 扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸配基，经过多轮筛选后获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子（aptamers），具有库容量大、亲合力高、靶分子范围广等优点，已成功运用于许多靶分子的筛选中，已经被广泛的应用于包括感染性疾病、肿瘤等的诊断制剂开发研究中，是极具潜力的新型小分子制剂。然而到目前为止，还未见将SELEX 筛选技术筛选的适配子用于应用于抗结核疫苗中作为增强BCG免疫佐剂的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能特异性结合BCG糖脂抗原ManLAM的DNA 适配子。

本发明的另一目的在于提供上述DNA 适配子在制备抗结核免疫佐剂中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种能特异性结合BCG糖脂抗原ManLAM的DNA 适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将其命名为BM2。通过随机单链DNA 文库以及引物的构建、双链DNA 文库的合成、SELEX筛选、PCR 扩增、亲合力测定、体外不同细菌结合实验等得到与BCG高特异性、高亲合力的DNA 适配子BM2。

所述的能特异性结合BCG糖脂抗原ManLAM的DNA 适配子的核苷酸序列还可以为SEQ ID No.1所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No.1同等功能的序列。

所述的能特异性结合BCG糖脂抗原ManLAM的DNA 适配子的核苷酸序列还可以为含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，如SEQ ID No.2由SEQ ID No.1所示序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。

上述能特异性结合BCG糖脂抗原ManLAM的DNA 适配子在制备抗结核免疫佐剂中的应用。