[发明专利]一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化和临床检验领域。具体而言，本发明涉及一种共价偶联方法。更具体而言，涉及一种将含氨基的分子共价偶联到微球上的偶联方法。

背景技术

在传统免疫比浊法当中，如果样本中待检测的抗原或抗体浓度太低、或者分子量过小，则抗原-抗体复合物极难形成浊度，除非放置比较长的时间。如要形成较大的复合物，则抗原和抗体的用量也相应增加。鉴于上述缺陷，便发展出了胶乳增强免疫比浊法。

胶乳增强免疫比浊法利用生物化学方法将抗体(或抗原)与微球结合。当样本中待检测的抗原(或抗体)与标记到微球上的抗体(或抗原)相结合时，便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物。这无疑改善了浊度的形成，增强了反应吸光度。利用生化分析仪进行比浊测定，整个分析过程只需几分钟，该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。

在进行胶乳增强免疫比浊法过程中，需要将抗体(或抗原)与微球进行结合。结合方式可以分为两大类：物理吸附或共价偶联。其中物理吸附是靠蛋白质分子结构上的疏水基团与微球表面的疏水基团间的相互作用，将抗原或抗体吸附到微球表面。共价偶联法是通过蛋白质与微球表面的化学基团发生反应，将蛋白质共价偶联在微球上。

共价偶联法由于特异性好、易保存、分散性良好等特点，现已广泛应用于体外诊断试剂中。市面上可见多种类型的微球，其中最为常见的是聚苯乙烯胶乳颗粒。很多胶乳颗粒表面带有化学基团包括但不限于羧基、氨基、酰肼、醛基、环氧基、巯基、羟基、金属基、硅羟基。这些基团，经过适当的反应，可以共价偶联上各种生物分子。其中，羧基胶乳颗粒可以采用多种策略进行活化，产生能够和蛋白质中的亲核基团(如氨基)发生偶联的反应性中间体。

目前为止，用于将蛋白质以及其它含氨基的分子偶联到羧基胶乳颗粒上最常见的反应策略是水溶性碳二亚胺(EDC，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)介导的方法。该方法可以通过两种模式来进行：一步法；或者两步法。

在一步法中，EDC直接加到蛋白质与微球混合液中，羧基胶乳颗粒被水溶性EDC激活而产生中间体酯，中间体酯可以直接与蛋白上的氨基发生反应。

在两步法中，先用EDC激活胶乳颗粒，再进一步加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)来生成另一个二级中间体酯(NHS-酯或Sulfo-NHS酯)。和一步法的中间体酯相比，NHS-酯或Sulfo-NHS酯在结构上更加稳定。因此，两步法的产量通常更高(Greg T.Hermanson.Bioconjugate Techniques.Academic Press，2010)。

偶联过程中，由于大多数蛋白质上同时存在有很多氨基(如赖氨酸、精氨酸残基)和羧基(如丝氨酸、苏氨酸残基)，过量的EDC容易介导蛋白质之间发生自我聚合，两步法能够克服这种缺陷，但是由于步骤繁多，不仅增加了时间成本，企业还不得不编写更多的SOP文件(操作规程文件)、不得不引入更多的质量控制环节。显然，从现代化的大规模生产的角度而言，两步法不是一种经济有效的方式。

相比较而言，一步法的步骤简单快捷，更适合大规模生产。但是，自我聚合现象会相对比较严重，这无疑导致了原材料的浪费、成本增加。并且，制备出来的试剂空白值较高，可以想象这势必会有损产品的空白检测限和灵敏度。此外，传统一步法制备的试剂在测绘标准曲线时线性较差，从而最终影响到待测样本的测定值。因此，本领域仍需要一种改进的一步偶联方法。

发明内容

发明人将只有两步法中才使用的NHS引入到一步法当中时，出乎意料地发现，通过这种方法所制备的试剂不仅空白低、线性也得到显著改善。并且，Sulfo-NHS比NHS显示出了更加优越的效果。

因此，根据本发明的一个方面，提供一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法，其包括步骤：

1)提供微球；

2)提供含氨基的分子；

3)将微球与含氨基的分子混合均匀，获得微球与含氨基的分子的混合物；

4)使步骤3)混合物同时接触碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，进行共价偶联反应；

5)收获偶联有含氨基的分子的微球，

其中所述步骤1)和步骤2)的顺序是可互换的。

在一些实施方式中，所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。