[发明专利]产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学应用技术领域，具体涉及一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌是一种重要的食源性致病菌，主要代表为大肠杆菌O157:H7。产志贺毒素大肠杆菌能产生志贺毒素，可以牛肉、鸡肉、水果和蔬菜等为载体传播，引起人得出血性肠炎、溶血性尿毒综合症等严重食物中毒并发症，严重者甚至会发生急性肾衰竭而死亡。产志贺毒素大肠杆菌主要毒力因子是位于噬菌体上的stx1、stx2基因，这两种基因分别编码志贺毒素Stx1、Stx2。

我国自1986年首次报告大肠杆菌O157:H7 感染的病例以来，曾于2001年在江苏、安徽等地两度暴发大肠杆菌O157:H7导致的感染性腹泻。共造成177人死亡，中毒人数超过2万人。这是迄今为止人类历史上最为严重的O157:H7感染疫情。近年来，世界各国产志贺毒素大肠杆菌的感染流行均呈上升趋势。非O157型产志贺毒素大肠杆菌引起的食物中毒并发症严重程度也在不断增加。2011年德国致病性大肠杆菌暴发的元凶亦为一种少见的血清型O104:H4。

随着对大肠杆菌O157:H7研究的深入，很多国家和地区相继报道发现了不产志贺毒素，即不具有致病性的O157:H7菌株。而现有的大肠杆菌O157检测方法只检测O157标志基因，如rfb_O157基因（食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法，SN/T 1869-2007），不能进一步判定大肠杆菌O157是否具有毒力。另外，由于stx1和stx2基因的不同亚型核苷酸序列差异较大，stx1基因的变种根据基因序列的差异，分为stx₁、stx_1c、stx_1d，而stx2基因的变种可分为stx₂、stx_2c、stx_2d、stx_2e和stx_2f，很难用一种通用引物同时扩增出所有基因亚型或主要基因亚型。再者，一个反应中使用的引物数目越多，引物之间越容易相互干扰，形成引物发夹环或引物二聚体，导致PCR扩增困难，检测灵敏度大大降低。因此，针对产志贺毒素大肠杆菌的PCR检测来说，设计一种能在一个PCR反应中完成志贺毒素编码基因和O157特征基因的检测，并能鉴别O157血清型大肠杆菌致病菌和检测出stx1和stx2基因及其常见亚型、具有特异性、广谱性的多重PCR引物比较困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、快速、简便、特异性强、广谱性好的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法及试剂盒在食品检测中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法，该方法通过三重PCR反应，经电泳染色、紫外观察，能同时检出stx1、stx2、wzy_O157基因，且stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和 stx_1c亚型，stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、 stx_2c和 stx_2d亚型，wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株；

所述stx1基因的检测引物为：

上游引物stx1F序列为SEQ.ID.No.1，

下游引物stx1R序列为SEQ.ID.No.2，

所述stx1基因的扩增序列为SEQ.ID.No.3；

所述stx2基因的检测引物为：

上游引物stx2F序列为SEQ.ID.No.4，

下游引物stx2R序列为SEQ.ID.No.5，

所述stx2基因的扩增序列为SEQ.ID.No.6；

所述wzy_O157基因的检测引物为：

上游引物wzyF序列为SEQ.ID.No.7，

下游引物wzyR序列为SEQ.ID.No.8，

所述wzy_O157基因的扩增序列为SEQ.ID.No.9。

为实现本发明的第二个目的，本发明采用如下技术方案：