[发明专利]一种多重荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种登革热、基孔肯亚和黄热病毒检测用多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起一系列临床症状，包括有生命危险的失血性休克综合征和较少见的伴有肝衰与脑病的急性肝炎。以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于全球热带和亚热带的60多个国家和地区，每年大约超过一亿人受到感染，死亡率高达50%，25亿以上的人受到威胁，该病毒的传播已成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。在大多数国家登革热的死亡率大约为5%，大多发生在儿童和青壮年中。

基孔肯亚病毒属于披膜病毒科的甲病毒属，在疾病流行地区，这种病毒可存在于绿猴、狒狒、黑猩猩、牛、马、猪、兔等多种动物体内，受感染的动物宿主和病人都是传染源。该病毒由受感染蚊子叮咬传播，能引起一种少见的病毒性传染病——基孔肯亚热。基孔肯亚热的病死率不高，除少数老年患者因身体衰弱而死亡外，成人感染者几乎没有死亡。该病一般持续五到七天，常会引起严重的关节痛使人失去能力，这种状况最终可以恢复，但剧烈疼痛和恢复缓慢的特点可明显影响人的正常生活和工作。2006年在印度和南亚的一次流行中，不止125万人感染基孔肯亚热病毒。2007年9月，意大利北部通报了由一例输入病例引起的一次基孔肯亚热暴发。基孔肯亚热近年来急剧复苏并扩大了地域范围，突出表明了我们对昆虫传播的新传染病的脆弱性，并强调了作为卫生安全基本要素的持续控制规划的重要性。

黄热病毒属于黄病毒科，此病毒是最小的人外RNA病毒之一，能引起黄热病等人类急性病毒性传染病，也是第一个被证实是由蚊类媒介传播的疾病。该病毒主要分布于南美和非洲地区，加起来涉及9亿多人口。估计全世界每年有20万人感染该疾病，3万人死亡。1907年继天花、鼠疫、霍乱后被当时《国际卫生公约》列为国际检疫传染病。在过去二十年中，由于人群对疾病感染的免疫力下降，加上砍伐森林、城市化、人口流动和气候变化等因素的影响，该病病例呈增加趋势。目前非洲、南美黄热病传播再趋活跃，加上当今世界间交往的频繁及交通工具的便捷，黄热病的传人以及赴流行区感染黄热病的危险性均在加大。为此，世界卫生组织已号召有关政府、部门和机构行动起来与黄热病作斗争。我国福建、广东、海南等地存在着该病的传播媒介，一旦传染有潜在的流行危险。故在我国保持对黄热病的警惕十分必要。

荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前已开发出利用荧光定量PCR技术分别针对上述三种病毒进行的快速检测试剂盒，但是由于是单一检测，三种病毒检测下来，既麻烦又浪费成本。因此在荧光RT-PCR技术的基础上，建立单管多重荧光PCR同时检测登革热、基孔肯亚和黄热病毒的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种登革热、基孔肯亚和黄热病毒多重荧光PCR检测试剂盒及其制备方法、检测方法，可用于单管同步检测登革热、基孔肯亚和黄热病病毒，用于临床对可疑感染患者进行病原学鉴别诊断。

本发明首先公开了一种登革热、基孔肯亚和黄热病毒的多重荧光PCR检测用引物及探针，所述引物和探针的组成如下：

登革热病毒

登革热病毒上游引物：5’-TGGGAGAGACCAGAGATCCTG-3’（SEQ ID NO：1）

登革热病毒下游引物：5’-ATTCAACAGCACCATTCCATTTTC-3’（SEQ ID NO：2）

登革热病毒探针：5’-荧光报告基团-TCTCTACAGCATCATT-荧光淬灭基团-3’（SEQ ID NO：3）；

基孔肯亚病毒

基孔肯亚病毒上游引物:5’-ACGAGGCAAGTTGTCTATTATGAG-3’（SEQ ID NO：4）

基孔肯亚病毒下游引物:5’-GGTAGAGCGTTGACCCTACTG-3’（SEQ ID NO：5）

基孔肯亚病毒探针:5’-荧光报告基团-AACAGCACACGGTCGCACGGTT-荧光淬灭基团-3’（SEQ ID NO：6）；

黄热病毒

黄热病毒上游引物:5’-TGCTAAGCTGTGAGGCAGTG-3’（SEQ ID NO：7）

黄热病毒下游引物:5’-CTAGACCCCGTCTTTCTACCAC-3’（SEQ ID NO：8）