[发明专利]克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的引物组及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种克隆植物病毒全基因组的引物组及方法，具体涉及一种克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的引物组及方法，属生物技术领域。

背景技术

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型成员。病毒粒体为杆状，大小620×15 nm，基因组为单一、正链的RNA，长约10 kb，其5′端连接基因组结合蛋白，3′端有poly (A) 序列。该基因组编码一个多聚蛋白，再经自身编码的蛋白酶降解形成10个多肽，即P1、HC-Pro、P3、6 K1、CI、6 K2、VPg、NIa、NIb和CP。SrMV可以与马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）和Poacevirus属的甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcane stripe mosaic virus，SCSMV）共同侵染甘蔗，引起甘蔗花叶病。典型症状是感病植株叶片出现黄绿相间不规则的花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一。甘蔗花叶病是甘蔗主要病害之一，容易造成甘蔗品种产量的下降，品质变劣，严重威胁我国的甘蔗产业的发展。根据我们前期的研究结果发现SrMV是引起我国甘蔗商业栽培种花叶病的主要病原，且至少存在6种不同的株系或基因型。

分离克隆SrMV病毒基因组的全长序列，对进一步研究病毒基因组结构和功能，分析侵染我国甘蔗的SrMV群体分子遗传，探索更为有效的抗病毒转基因分子育种途径奠定坚实的基础，对甘蔗花叶病的防治具有重要意义。分离植物病毒基因组的常规方法是首先从感染病毒的植物叶片提纯病毒，然后利用纯化病毒的RNA测序，获得全长基因组序列。由于SrMV常常与SCMV或SCSMV混合侵染甘蔗，分离纯化极其困难，而且耗费时间较长，实验步骤非常繁琐，需要贵重的超速离心机。通过提取感病的植物叶片总RNA进行RT-PCR克隆是一种简便的方法，但是由于基因组RNA序列长达约10 kb，难以通过1次RT-PCR克隆获得全长基因组序列。国内外有关SrMV基因组信息非常有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的引物组及方法。具体提供了一组能扩增片段相互重叠且覆盖SrMV基因组RNA全长序列的引物组；还提供了一种简便、快速的克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现。

本发明的克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的引物组，包括7对分段克隆引物或简并引物，引物或简并引物序列如下：

SrMV-5F1：5'-AAAACAACAAGACTCAACACAACA-3'

SrMV-5R1：5'-GGCTGCRAARTGTTCCAT-3'

SrMV-F1：5'-TCACGGTTCAAGMGCAAGG-3'

SrMV-R1：5'-GAATGTAATGGCAAATCKGC-3'

SRMV-F2：5'-CAAGCCATGTCATATTGGATAG-3'

SRMV-R2：5'-GGTGCTTCCATTATRTGACA-3'

SRMV-F3：5'-GCAGCAACAGTTAGCATAGG-3'

SRMV-R3：5'-TGCGYGGTAACGAGTAAGG-3'

SrMV-F4：5'-GATAGCMACAGAAGCAGCCT-3'

SrMV-R4：5'-ATTCCWACRGTCCAAGGTC-3'

SrMV-F5：5'-TGAATGCMGCAGTWGGAG-3'

SrMV-R5：5'-CGCTGAAGTCCGTATCTTG-3'

SrMV-F6：5'-TTGGACMATGATGGATGGAG-3'

SrMV-R6：5'-CTCTTGCYACAAKACTCGCAGC-3'。

利用本发明的克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的引物组，克隆高粱花叶病毒甘蔗分离物全基因组的方法，包括以甘蔗叶片总RNA为模板，进行RT-PCR扩增、电泳检测、RT-PCR产物的克隆与序列测定、SrMV基因组全长序列拼接；其特征在于：

（1）RT-PCR扩增