[发明专利]一种表征类病毒颗粒及其聚集体大小的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速表征类病毒颗粒的方法，特别是涉及一种采用非对称垂直流场流分级技术对类病毒颗粒及其聚集体进行表征的方法。

背景技术

类病毒颗粒(VLP)是由重组病毒衣壳蛋白通过自组装形成的生物大分子，其结构与病毒非常类似，具有非常重要的应用价值。一方面，VLP可以用做疫苗刺激机体产生免疫应答，使机体免受病毒的感染。同传统减毒疫苗相比，VLP疫苗的安全性更高，已经在医疗卫生行业中得到了广泛的应用；另一方面，VLP在基因载体、药物治疗等方面的应用潜力引起了研究者的普遍关注，相关的研究已经成为生物技术领域的热点。然而，类病毒颗粒的应用依然面临一些挑战。类病毒颗粒的结构非常复杂且比较脆弱，在下游的分离纯化和制剂过程中容易受到溶液环境、界面作用的影响产生结构变化，并进一步导致生物活性的大量损失。聚集、裂解是其变性失活最主要的原因，研究类病毒颗粒聚集、裂解的关键在于能够快速、准确地检测其尺寸信息。

目前常见的类病毒颗粒的表征方法有扫描电镜(TEM)，多角度激光散射(MALLS)等。TEM的检测过程涉及到类病毒颗粒与界面的相互作用，这些作用本身就可引起VLP的结构变化；MALLS虽然可以表征颗粒的尺寸，但其检测之前需要很多仪器常数的校正，而且检测结果易受环境因素的影响。本发明采取了一种新型、无介质填充的色谱方式——非对称垂直流场流分级来表征类病毒颗粒的尺寸信息，可以做到无干扰、准确的表征。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法。

本发明的目的是克服传统表征手段存在的缺陷，通过非对称垂直流场流分级技术(AF4)来表征类病毒颗粒及其聚集体的大小。此方法简便快速，可以较为真实的保留样品颗粒的原貌，从而得到其准确的粒径信息。本发明以乙肝表面抗原类病毒颗粒(HBsAg-VLP)在盐溶液中的聚集为例来说明，但本发明的保护范围不止于此。

该发明提供的VLP的表征方法可按照如下步骤来进行：

(1)使用非对称垂直流场流分级标定不同粒径的标准颗粒的保留时间，并建立线形标准曲线；

(2)将不同溶液体系或反应条件下的类病毒颗粒使用非对称垂直流场流分级进行表征，得到类病毒颗粒及其聚集体的保留时间；

(3)通过标准曲线计算类病毒颗粒及其聚集体的水力学半径；

(4)根据类病毒颗粒及其聚集体的水力学半径计算结果表征其结构。

本发明与传统技术相比，其优势在于场流分级的腔室中没有介质的填充，只要外场强度合适，样品会平衡在距离腔室底部一定高度的位置，不会出现样品与固体界面相互作用的现象。此外，场流分级可耐受的流动体系范围很宽，可以考察不同溶液环境下样品的真实变化情况。

附图说明

图1为不同标准颗粒的保留时间与粒径的拟合标准曲线；

图2为不同盐浓度条件下HBsAg的场流分级结果；

图3为图2中各样品透析除掉硫酸铵后的分级结果。

具体实施方式

本发明的方法通过以下实施例进行详细说明。

实施例1：

将0.5mg/ml的HBsAg-VLP溶液进行分级，可以得到HBsAg-VLP的保留时间为3.08min，根据步骤2中拟合得到的方程计算HBsAg-VLP的粒径为28.3nm。

实施例2：

将0.5mg/ml的HBsAg-VLP溶液分别与不同浓度的硫酸铵溶液等体积混合，室温下静置2h反应，将每个样品按照步骤1所示的场流分级条件进行分级，得到的分级结果如图2所示，随着盐浓度的升高，样品聚集现象加剧，聚集速度增大，当把盐透析除掉之后，各样品的分级结果如图3所示，根据可见低盐条件下聚集可逆，高盐条件下聚集不可逆

实施例3：

从尺寸信息可以计算得到HBsAg-VLP首先在低盐溶液条件下可逆聚集形成了4聚体，而后在高盐溶液条件下进一步不可逆聚集形成多聚体。