[发明专利]一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。

背景技术

嘌呤和嘧啶与体内核酸代谢密切相关，嘌呤又与能量代谢直接相关。一方面，磷酸核糖焦磷酸合成酶（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase，PRPS）是体内唯一催化磷酸核糖焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase，PRPP）合成的酶，PRPP是体内嘌呤、嘧啶从头合成和补救合成的重要底物，同时也是该通路上的重要调节因子[Sudha Mannava, Vladimir Grachtchouk, Linda J. Wheeler. Direct role of nucleotide metabolism in C-MYC-dependent proliferation of melanoma cells. Cell Cycle，2008，7(5)：2392-2400]。另一方面，体内细胞能直接利用的最普遍的能量提供化合物——腺嘌呤三磷酸核苷（Adenosine Triphosphate，ATP）是PRPS的底物，而ATP所含有的腺嘌呤成份又需要以PRPS催化的产物作为底物合成，因此，嘌呤代谢紊乱将导致体内能量代谢紊乱。

PRPS2是PRPS家族成员之一，由PRPS2基因编码。PRPS2基因是位于X染色体短臂Xp22.2-p22.3的管家基因，几乎在所有细胞中均有表达，在增殖较快的组织如胸腺、肺、胃、小肠、脾和睾丸组织中表达量较高。肿瘤组织是细胞增殖旺盛的组织，其核苷酸的从头合成是肿瘤细胞增殖的首要步骤。阻断肿瘤细胞核苷酸的从头合成也是目前临床广泛应用的抗代谢类肿瘤化疗药物（如5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和环胞苷等）的作用机制。利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）表达载体，对PRPS2基因的表达进行特异性抑制，有望阻断肿瘤细胞的恶性增殖和生长，进而达到治疗肿瘤的目的。

RNAi是由双链RNA 分子介导的序列特异性转录后基因沉默现象，已成为人类基因功能研究的有力工具，同时在基因干预治疗的应用中具有很大潜力。特别是应用RNAi 技术在哺乳动物细胞中高效特异阻断特定基因的表达，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新方法。RNAi 常用两种方法: siRNA 和shRNA。siRNA合成的成本较高，作用时间相对短暂，而且长双链RNA在哺乳动物细胞中会诱发细胞毒效应。而shRNA 方法对靶基因的作用持续时间、细胞的毒性反应以及合成价格等方面有一定的优势，因此使用shRNA 进行RNA 干扰是目前较为常用的方法[Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R．A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science，2002，296(5567)：550-553]。

shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，利用载体把编码目标shRNA的DNA序列导入细胞，载体中的启动子可启动该序列表达为特定shRNA。这种重组了编码shRNA载体的DNA序列可随着细胞的增殖而被传递到子代细胞中去，从而使目标基因的沉默可被遗传。导致目标基因表达降低（沉默）的机制是：shRNA在细胞胞液中可形成发卡结构，然后被细胞液中特定的酶切割成siRNA；siRNA结合到RNA 诱导沉默复合物 (RNA-induced silencingcomplex，RISC) 上；RISC结合到目标基因转录形成的mRNAs上，在其他酶的作用下将其降解，达到目标基因沉默效应[ Paddish PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al．Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Gen Dev，2002，16：948-958.]。