[发明专利]鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养方法，该方法适用于椎间盘组织工程学，椎间盘移植术以及药物防治椎间盘退变等多方面的研究。

背景技术

脊柱退变性疾病的病理基础是椎间盘退变。它包括了颈椎病和腰椎间盘突出等疾病，发病率逐年升高并严重危害中老年人的身体健康。通过退变产生的脊柱失稳、椎管狭窄刺激或压迫肌肉、神经根、血管和脊髓，甚至通过脊神经反射影响内脏功能。目前临床治疗手段大部患者采用保守的对症治疗以拖延病情发作，少数患者手术治疗摘除病变的椎间盘。开发针对病理环节的药物需要有以椎间盘为对象的实验平台支撑，由于缺少椎间盘细胞株，而传统二维平面培养的原代椎间盘细胞，难以保持其该有的生物学特性。

发明内容

针对传统二维平面培养的上述不足，根据实施例，希望提出较好的保持了椎间盘的生物学特性，可操作性强，成功率高的鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养方法，在椎间盘移植术以及药物防治椎间盘退变的治疗及研究方面具有广阔的前景。

根据实施例，本发明提供的一种鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养方法，包括如下步骤：

用磷酸盐缓冲液(缩写PBS，pH值7.2～7.4：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)缓冲液配制浓度为2wt%的琼脂糖凝胶，与含10wt%胎牛血清（Fetal Calf Serum，缩写FBS，Biowest公司订购）的细胞培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，缩写DMEM，Biowest公司订购）培养液按体积比1：1混合形成三维培养胶；

将从活体C57品系小鼠上剪切下来的鼠尾立即消毒并剥皮后投入PBS中清洗；在体视学显微镜下，剥除椎旁韧带显露椎间盘，沿上下软骨终板完整的切下椎间盘，用PBS清洗；将前述三维培养胶铺平培养皿，将椎间盘快速种植入三维培养胶内，待凝固后再加入含10wt%FBS的DMEM培养液覆盖表面，放入培养箱内，每天更换含10wt%FBS的DMEM培养液一次。

根据一个实施例，本发明前述鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养方法中，进一步包括如下步骤：从培养箱内取出培养皿，在37℃恒温水平摇床内以60rpm频率摇晃，每次60分钟，每日早晚各一次，连续刺激两天。

随后的实施例将证明，本发明方法成功的实现了鼠尾椎间盘的体外培养，克服了传统二维平面培养的缺点，较好的保持了椎间盘的生物学特性，本发明可操作性强，成功率高。随后的实施例通过多种技术方法：显微镜下连续观察、模拟力学刺激、特殊病理切片染色、PCR定量分析力生长因子和胶原和蛋白等基因表达，最终证实了本发明方法成功的在体外连续培养鼠尾椎间盘达12天。本发明方法适用于椎间盘组织工程学，椎间盘移植术以及药物防治椎间盘退变等多方面的治疗及研究。

附图说明

图1为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的显微解剖图。

图2为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的椎间盘种植图。

图3为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的连续观察图。

图4为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的病理切片藏红固绿染色图。

图5a为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的MGF原位杂交图（椎间盘和纤维环部分）。

图5b为本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养的MGF原位杂交图（髓核和软骨终板部分）。

图6是IGF基因选择性剪接示意图（据此设计PCR引物和原位杂交的位点）。

具体实施方式

本发明方法利用三维胶体外立体培养椎间盘细胞，以维持其生物学特性，方便实验研究的目标。下面结合附图和具体实例，进一步阐述本发明鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养技术。这些实例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本实用鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本实用鼠尾椎间盘体外三维胶立体培养技术权利要求所限定的范围。

1、椎间盘体外培养三维胶的配制

PBS配制2wt%琼脂糖，高温高压灭菌，趁热分装于50ml离心管，每管10ml室温下冷却凝固，常温保存。使用时在微波炉中火加热1min融化后，温水中与10wt%FBS的DMEM培养液按体积比1：1溶合成三维培养胶待用。

2、鼠尾椎间盘的显微手术完整分离步骤