[发明专利]含猪圆环病毒2型细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒细胞的培养方法，尤其是涉及含猪圆环病毒2型细胞的培养方法。

背景技术

以猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type2，PCV2)为主要致病因子引起的疾病统称为猪圆环病毒病(PCV2-associated disease，PCVAD)。目前，PCVAD已在全世界范围内发生与流行，是危害养猪生产的严重传染病之一。对于PCV2造成的相关疾病尚无有效的预防措施，使用PCV2抗原制成的疫苗在猪圆环病毒病的预防中初见成效。随着针对PCV2引起的相关疫苗、诊断试剂和治疗方法的形成与发展，需要有效可靠的方法来获取足量的PCV2病毒。目前，对PCV2的培养都建立在猪肾PK15细胞系上。由于PCV2体外培养不产生细胞病变，病毒增殖能力差，病毒毒价低，病毒含量通常低于10^5.0TCID₅₀/ml，因此该培养方法的病毒含毒量难以满足制备疫苗的要求。

国内多家单位研究通过对PK15母细胞进行有限稀释和细胞克隆，得到对PCV2具有高敏感性的细胞系，其它类型的细胞系进行有限稀释和细胞克隆的报道也不少。目前关于该病毒毒价的研究主要技术路线是采用D-氨基葡萄糖处理细胞增强病毒的增殖能力，或者采用病毒在细胞连续培养传代，使分离株随细胞传代次数的递增，病毒滴度有所升高；但研制周期长，工艺复杂，产品质量较难控制，成本较高，不利于规模化生产价格合理的疫苗。目前，国内外尚无通过含猪圆环病毒2型的PK15细胞进行有限稀释和细胞克隆进行培养猪圆环病毒2型的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺简单、病毒滴度高、生物学特性稳定的含猪圆环病毒2型细胞的培养方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

含猪圆环病毒2型细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)单个含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆及其亚群的培养

将PCV2/SN07-12种毒接种于无1型猪圆环病毒污染的猪肾细胞(PK15细胞)中并在37℃培养箱中培养，使用胰酶消化处于对数生长期的单层含猪圆环病毒2型的PK15细胞，然后采用有限稀释法，按照每孔100uL含20wt％(请审核修改)牛血清细胞生长液，0.5个细胞/孔的密度，加入96孔细胞培养板置于含5vt％CO₂，温度为37℃培养箱中培养，挑选有单个细胞生长的细胞孔中细胞进行亚克隆培养，使用胰酶消化后，加入牛血清细胞生长液，再加入96孔细胞培养板置于含5vt％CO₂，温度为37℃培养箱中培养72h；

(2)阳性含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆株的筛选

取长满单层96孔细胞培养板，弃去培养液，PBS洗涤细胞3次，经无水乙醇在-20℃固定2h，封闭液洗涤1次，再利用封闭液在37℃作用30min，加入PCV2抗血清，37℃作用45min，PBS洗涤细胞3次后，加入荧光标记A蛋白(FITC-SPA)，37℃作用45min，洗涤3次后加加封片液(Mounting-Fluid)，于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，以未接毒的正常PK15细胞作为阴性对照，挑选荧光数量最多的克隆株为猪圆环病毒2型高感染性的PK15细胞亚群，重复克隆一次，每次克隆均需做感染比例检测，对含猪圆环病毒2型PK15细胞株进行纯化后获得含PCV2高感染比例的PK15-Ag细胞系。

(3)高滴度猪圆环病毒2型的增殖

利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞系并接种于细胞培养瓶内，加入含7wt％-10wt％犊牛血清的DMEM营养液，在37℃培养24h，弃生长液，加入含2wt％犊牛血清的DMEM维持液，于37℃培养72-96h，收获细胞培养物，冻融3次，既得到高滴度猪圆环病毒2型，IFA方法测定的病毒滴度达10^7.0TCID₅₀/ml。

步骤(1)中所述的PCV2/SN07-12种毒为圆环病毒属猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type2)的微生物保藏登记号为：CCTCC NO：V201304其微生物保藏号是：CCTCC NO：V201114；保藏时间：2013.3.15；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION(CCTCC)；保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。