[发明专利]猪α-干扰素复合制剂的制备方法

权利要求书

1.一种猪α-干扰素复合制剂的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）人工合成150bp的短小乳酸杆菌信号肽序列，包括SP上游的酶切位点NdeⅠ及下游的酶切位点，下游的酶切位点依次为KpnⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、Pst I、SphⅠ、Hind Ⅲ和EcoR I，并克隆到PUCK载体，构建出pUCK-SP载体；

（2）通过PCR方法从 pMD18-IFN-α载体上扩增出501bp的猪IFN-α基因序列，并插入pUCK-SP载体的KpnⅠ和EcoR I酶切位点，构建出pUCK-SP-IFN-α质粒，pUCK-SP-IFN-α质粒经NdeⅠ和EcoR I酶切，回收SP-IFN-α片段；

（3）根据Genbank发表的干酪乳酸杆菌乳糖操纵子基因序列，设计1对特异引物，上游引物5’端加入PstⅠ酶切位点，下游引物5’端依次加入KpnⅠ、NdeⅠ酶切位点，利用PCR方法从干酪乳酸杆菌基因组DNA中扩增出298 bp乳糖启动子plac序列，利用T₄DNA连接酶把乳糖启动子片段和SP-IFN-α片段连接，然后使用乳糖启动子上游引物和猪IFN-α下游引物通过PCR扩增串联出plac-SP-IFN-α片段，将plac-SP-IFN-α片段连接到穿梭载体pIAbeta8，转化DH5α感受态细胞，构建干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8-plac-SP-IFN-α；

（4）通过电转化方法，把干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8-plac-SP-IFN-α转进干酪乳酸杆菌感受态细胞，在氯霉素固体培养基上培养48小时，筛选出阳性菌株，然后，用溶菌酶破壁方法提取阳性菌株质粒，得到猪α-干扰素复合制剂。

2.根据权利要求1所述的猪α-干扰素复合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中pUCK-SP载体序列如下：

catatgatgc  aatcaagttt  aaagaaatct  ctttacttgg  gccttgccgc  attgagcttt   60

gctggtgttg  ctgccgtttc  aacgactgct  tcagctacgg  gtacccgggg  atcctctaga 120

gtcgacctgc  aggcatgcaa  gcttgaattc                                150。

3.根据权利要求1所述的猪α-干扰素复合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中特异引物序列为：

plac F：5' –GCGCTGCAGTAGCACTGATCATTAAAG- 3'

plac R：5' –TAGGTACCCATATGTTTTGGCAAGTTGTCAT- 3'。

4.根据权利要求1所述的猪α-干扰素复合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中乳糖启动子plac的序列为：

tagcactgat   cattaaagaa   caaaaggcaa   cacagataat  tgtcctaaaa  aactgacgat   60

ggcttgctgg   atggacactg   ttgaaaaaga  aaaaagaaca  gcaaactaaa  gatgctacaa   120

aaaataaaat   aaaacgttta    cattctgttc   agattatggt   acaacttgtt   tgttgatagg    180

aatattcaat    gtggattgtg    actatttaat   taggcgagac  cacaaatcgc  agtgctgatc   240

gcagcgcgt   gatttgtggt     tttttctttg   cactgggagg   ggatgacaac  ttgccaaaa   298。