[发明专利]鉴定龙须菜981良种的特异性探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及海洋藻类的优良品系鉴定，特别涉及鉴定龙须菜981良种的特异性探针及其应用。

背景技术

红藻龙须菜是重要的产琼胶海藻，目前，经青岛湛山湾野生种群选育而来的龙须菜981良种具有生长快速，分支多，耐高温，速生抗逆，琼胶含量高且好，已在福建南部海区、广东省汕头市南澳岛等地栽培多年，并在广东、福建、浙江、山东及辽宁沿海建立了龙须菜栽培产业，但其与野生龙须菜在外观形态上难以区分，之前都是通过测定二者的生长性状和生理生化指标来加以区别的的。本发明提供两段核酸序列及其应用，采用该技术可快速、准确鉴定981良种，解决龙须菜在栽培过程中产生的种苗混杂现象，避免对龙须菜栽培产业造成重大损失。

通过测定并测量生长性状和生理生化指标来加以区别，试验周期长，操作繁琐。本发明提供两段核酸序列，可快速、准确鉴定981良种，解决龙须菜在栽培过程中产生的种苗混杂现象，避免对龙须菜栽培产业造成重大损失。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供两条探针，可快速、准确鉴定龙须菜981良种，解决龙须菜在栽培过程中产生的种苗混杂现象，避免对龙须菜栽培产业造成重大损失。

本发明提供的鉴定龙须菜981良种的特异探针，所述的特异性探针序列为：

具有序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列；

在上述方案的基础上，所述探针由地高辛标记试剂盒进行标记。

上述鉴定龙须菜981良种的特异性探针用于龙须菜981良种的鉴定。

利用上述特异性探针鉴定龙须菜981良种的方法，使用southern印迹杂交的方法进行鉴定。

上述鉴定龙须菜981良种的方法的具体步骤如下：

(1)提取龙须菜基因组DNA；

使用CTAB法提取龙须菜基因组DNA；

(2)基因组DNA的限制酶切；

采用EcoR I、EcoR V和EcoR V、Hind III两对酶切组合分别对步骤(1)所得到的龙须菜基因组DNA进行酶切；

(3)Southern Blot；

将凝胶放入培养皿中，加入20ml变性液，摇动变性1h，倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次；换中和液20ml，摇动1h，之间更换一次中和液；在电泳槽内加适量转移液20×SSC，中间支架放一滤纸条，滤纸两端浸没在20×SSC中，取出中和的凝胶，点样孔朝下倒扣于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡，将与胶大小相同的尼龙膜放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20×SSC中浸泡5min，盖在凝胶上面；将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，吸水纸上压0.5-1kg重物，转移12h。转移后，在膜上做标记，明确膜的正反，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，在2×SSC溶液中浸润，120℃烘烤30min；

(4)膜的预杂交、杂交；

添加37-42℃预热的DigEasyHyb5ml，封膜，预杂交30min，探针100℃5min变性后迅速置于0℃，倾去预杂交液，重新添加2ml预杂交液以及10ng变性标记探针，封膜，42℃杂交过夜，杂交完成后倒出杂交液，将膜放入小烧杯中加8ml的2XSSC，0.1％SDS，室温洗涤5min，重复一次，倒出洗膜液，加8ml的0.5XSSC，0.1％SDS，65℃洗涤15min，重复一次；

(5)显色；

膜于小烧杯中加5ml缓冲液I，洗涤5min，倒去缓冲液I，加10ml缓冲液II，室温放置30min，再倒去缓冲液II，膜置于培养皿内，添加10ml缓冲液II，室温30min，将膜取出置于小烧杯中，加50ml缓冲液I，洗涤15min，重复一次，倒去缓冲液I，加缓冲液III10ml，放置5min，倾去缓冲液III，加5ml显色液，置于暗中静止待显色，显色结束取出膜加3ml蒸馏水，洗涤5min，空气干燥；

(6)结果观察；

龙须菜样品的酶切基因组DNA片段与探针杂交结果显示：龙须菜981良种在600bp、500bp左右位置出现了条带，而其他品系个体中均无条带出现。

本发明所述的两条特异性探针，可以快速而准确地鉴定龙须菜981良种。

附图说明：

图1龙须菜样品的酶切基因组DNA片段与SEQ ID NO：1探针杂交结果显示；