[发明专利]利拉鲁肽的固相制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及利拉鲁肽的固相制备方法。

背景技术

随着生活水平的提高和生活方式的改变，近年来，我国糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等，继而引发体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发严重的并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。

II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。其中，利拉鲁肽（liraglutide）是GLP-1的受体激动素之一，2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽（商品名为Victoza）注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。利拉鲁肽的化学表述为Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-1^7-37，分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，分子式如式I所示，与天然GLP-1相比，药效相当且作用时间更长。

目前，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；但由于需要采用基因重组技术，技术难度大，成本相对较高，同时由于Arg³⁴-GLP-1（7-37）-OH的侧链处于未保护状态，和N^α-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多杂质，损失较大。还有报道固相逐步偶联的方法进行制备，由于利拉鲁肽的序列中有很多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致粗肽中和产品性质相近杂质较多，HPLC制备比较困难，收率较低。因此，提供一种产品收率高、成本低廉的利拉鲁肽制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种利拉鲁肽的固相制备方法。该方法将困难序列或包含困难序列的单个片断连接到树脂上，其他区域仍采用逐步偶联的方法进行氨基酸连接,粗肽纯度和收率都显著提高，且成本相对较低。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利拉鲁肽的固相制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备获得第一多肽片段-第一树脂，第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

步骤2：制备获得第二多肽片段-第二树脂，第二多肽片段-第二树脂中第二多肽片段的氨基酸序列包含如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；

步骤3：取第二多肽片段-第二树脂，经第一裂解后获得第二多肽片段；

步骤4：取第二多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得第三多肽片段-第一树脂，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸，经第二裂解、纯化，即得。

在本发明的一些实施例中，第二多肽片段具有如下氨基酸序列中的任意一个：

如SEQ ID No.2所示；

或如SEQ ID No.3所示；

或如SEQ ID No.4所示；

或如SEQ ID No.5所示；

或如SEQ ID No.6所示；

或如SEQ ID No.7所示；

或如SEQ ID No.8所示；

或如SEQ ID No.9所示；

或如SEQ ID No.10所示；

或如SEQ ID No.11所示；

或如SEQ ID No.12所示；

或如SEQ ID No.13所示。

在本发明的另一些实施例中，第三多肽片段-第一树脂中第三多肽片段具有如下氨基酸序列中的任意一个：