[发明专利]一种检测肺细胞NLK表达的方法及应用和NLK的应用

说明书

技术领域

本发明细胞生物学，特别涉及肺细胞蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)。

背景技术

目前发现了多种可以作为肺癌诊断和治疗的分子靶点，包括表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、Akt、KRAS和ERCC1等等，相关分子标记物的发现和靶向治疗的研究对于肺癌的临床治疗和病人生存率的提高具有极为重要的积极意义。但是，肺癌的诊断和治疗还存在很多不足之处。由于肺癌存在多种病理类型和分子标记物变化，在肺癌中依然没有公认的可以作为诊断性指标的分子标记物，并且对肺癌的靶向治疗目前依然靶点有限。蛋白激酶NLK为一类重要的癌症调控分子。NLK是一个非典型的MAPK样蛋白激酶。NLK可能对p53、TGF-beta和NF-κB等信号通路均有负向调节作用。NLK在癌症组织中的表达及其对癌症发生的调节作用目前研究较少研究表明，其即可能在某些癌组织中高表达，也可能在一些癌组织中低表达。检测NLK的表达有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肺细胞NLK表达的方法。使用NLK作为生物标记物检测可以用来肺细胞。

根据本发明的一个方面，提供了一种检测肺细胞蛋白激酶NLK表达的方法，采用免疫印迹检测或免疫组化检测，免疫印迹检测使用GAPDH作为内参基因，PCNA作为细胞增殖标记物。

根据本发明的一个方面，免疫印迹检测的步骤为：

(1)细胞或组织样品从-80℃取出，在冰上融化5min；

(2)加入适当的细胞裂解液，对于组织样本，利用手动碾磨器进行碾磨十分钟；细胞样品则重悬细胞后冰上裂解30min，之后13000rpm，4℃离心15min；

(3)取上清，以BCA法测定裂解后的蛋白浓度；

(4)确定蛋白浓度后，以5×上样缓冲液(500mM Tris-Cl，pH＝6.8，10％Glycerol，10％SDS，0.1％BPB，0.2M DTT)和去离子水调整蛋白浓度，样品煮沸5min；

(5)将样品以12％SDS-PAGE分离，分离后，将蛋白转膜至PVDF膜(Roche)上；

(6)封闭液(5％脱脂牛奶，以TBST配制)封闭1h；

(7)以抗NLK、GAPDH和PCNA的一抗孵育过夜；TBST洗涤3×5min后，二抗孵育2h；

(8)最终蛋白条带以化学发光法(ECL)显影。

根据本发明的一个方面，疫组化检测的步骤为：

(1)切片及烤片：石蜡包埋的待检组织5mm连续切片，贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃电烤箱中烤片8h以上；

(2)组织切片的脱蜡、水化步骤：二甲苯15min×2次(60℃烤箱中放置)→无水乙醇10min(2次)→95％乙醇5min(2次)→80％乙醇5min→70％乙醇5min→流水冲洗→dd H₂O浸泡5min，PBS冲洗3min×3次；

(3)以H₂O₂抑制内源性过氧化物酶活性：3％H₂O₂(37℃于恒温培养箱内，下同)孵育40min，PBS冲洗3min×3次；

(4)封闭：以封闭液(1％BSA，10％正常驴血清，以PBS配制)室温封闭2h左右；

(5)一抗孵育：甩去切片上的封闭液，滴加封闭液稀释的一抗，室温孵育1h后4℃过夜，PBS冲洗3min×3次；

(6)小心地擦拭去玻片上多余的水分，滴加一定量的显色试剂1，37℃孵育20min，立即用PBS冲洗3min×3次；

(7)试剂2；小心地擦拭去玻片上多余的水分，滴加一定量的显色试剂2，37℃孵育20min，立即用PBS冲洗3min×3次；

(8)DAB显色：将切片以DAB工作液孵育2～5min，同时仔细观察控制显色强度，待出现阳性反应，则置流水下冲洗终止DAB显色反应；

(9)染核：苏木素复染核30s～2min，以流水冲洗后，1％盐酸-乙醇分化；

(10)脱水：70％的乙醇3min→80％的乙醇3min→95％的乙醇5min→无水乙醇5min→二甲苯8min(2次)；

(11)免疫组化封片：以中性树脂封片，通风橱中晾干后，在显微镜下观察和拍摄免疫组化结果，进行统计分析；以棕黄色或黄色结果作为阳性，以无显色作为阴性结果。