[发明专利]一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，同时还涉及 试剂盒试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。

背景技术

结核病是一种严重的传染性疾病，是当今世界面临的主要公共健康问题之一，曾在世界 范围内出现过大流行。它的病原体是结核分枝杆菌，属分支杆菌属。随着比较有效的抗结核 药物的出现，结核病的发展在全球得到过充分的抑制，但是近些年来由于结核分枝杆菌多重 耐药菌株的出现，使结核病的发病率又再度回升，全球结核病形势出现了恶化趋势。据WH O统计，全球约有1/3的人口（约20亿）被结核分支杆菌感染。据我国在2000年的第四次 全国结核病流行病学的抽样调查结果估算，我国约有450万活动性肺结核病人，每年有13 万人死于肺结核，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数为世界第二。

早期的诊断治疗对于结核病的预防和治疗有着非常重要的作用，现阶段的诊断包括痰涂 片法、痰结核菌培养、X线检查和血清学检测等方法。其中，血清学检测由于其操作简便、 成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，在对结核病的检测方面应用前景非常广 阔，但是现在所使用的抗原存在着特异性差、假阳性率高的缺点，并且现在的一些商业试剂 盒检出率低、假阳性率高，因此急需研发出更为有效的特异性抗原来提高血清学检测的效果。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，本试剂盒由一对混合抗原 组成，为Rv2309A和Rv3872，其序列分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。单一 抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，而混合抗原的出现可以克服这一缺点。并且， 混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。

本发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核分枝杆菌 试剂中的应用，本试剂盒与商业试剂盒TB-DOT相比，其灵敏度，精确性和特异性都要优 于TB-DOT。和商业试剂盒TB-CHECK-1相比，在灵敏度和精确度方面都要优于TB-CHEC K-1。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明通过基因工程手段，将结核分枝杆菌Rv2309A和Rv3872蛋白在体外表达、纯 化，并将Rv2309A和Rv3872蛋白混合制备混合抗原及抗原诊断试剂盒，这两个试剂盒能 特异性的检测结核分枝杆菌的抗体，能区分经卡介苗免疫的健康人群和被结核分枝杆菌感染 的患结核病的人群。可用于结核病的临床血清学检测。

一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括以下组份：

包被液：0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液；

洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液；

封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2MH₂SO₄；

抗原Rv2309A，其序列为SEQIDNO.2所示；

抗原Rv3872，其序列为SEQIDNO.3所示。

一种结核分枝杆菌基因表达载体组氨酸标签融合表达载体pETXba的构建方法，其步骤如下:

（1）将商业购买的载体pET28a上的XbaⅠ酶切位点消除，获得一个中间载体pET28a-ΔX；

（2）将步骤（1）获得的载体pET28a-ΔX用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；

（3）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的cdc62基因作为第一个媒介基因，通过PCR的方 法从极端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增获得末端含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的cdc 62媒介基因；

（4）将步骤（3）获得的媒介基因cdc62用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；

（5）将步骤（2）获得的载体和步骤（4）获得.的媒介基因在16℃连接过夜，得到第二个中 间载体pET28a-62；

（6）将步骤（5）获得的载体pET28a-62用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行消化；

（7）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒介基因， 通过PCR方法获得末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点的MCM媒介基因；

（8）将步骤（7）获得的MCM媒介基因用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶消化；