[发明专利]基于蛋白质的壳聚糖纳米颗粒的制备方法及其作为核酸药物载体的应用

说明书

技术领域

    本发明涉及一种基于蛋白质的壳聚糖纳米颗粒的制备方法及其作为核酸药物载体的应用，属于高分子纳米材料及生物化学领域。

背景技术

核酸药物是如今研究的热点，siRNA是一类具有多种生物学功能，长度为20至25个核苷酸长的双链RNA分子。siRNA参与RNA干扰（RNAi）途径，干扰特定基因的表达，用于基因治疗。然而，由于siRNA的尺寸和带负电的特性，导致其难以进入细胞，因此如何载带它们进细胞始终是个难题。壳聚糖是自然界中唯一一种带正电荷的天然碱性多糖，它存在范围广、廉价易得、无毒副作用、生物相容性极好、易于表面修饰、并且可生物降解，具有十分优异的生物活性，在生物医学领域应用十分广泛。本发明就利用一种新方法制备的壳聚糖纳米颗粒，其表面带有大量的正电荷，通过静电吸附核酸药物，将核酸药物成功载带进入细胞。由于壳聚糖极好的生物学特性，因此该纳米颗粒是一种生物安全性极好的理想的核酸药物载体，这对于核酸类药物的研发具有重要的意义。 

本发明的实施案例中制备了包裹十分常见且廉价的牛血清白蛋白（BSA）的壳聚糖纳米颗粒，并在其表面吸附siRNA，这种方法制备的纳米颗粒尺寸很小（20nm左右），具有很大的比表面积，分散性稳定性很好，并且表面带有大量正电荷（Zeta电势约 +38mV），可以在其表面吸附大量的siRNA药物，使得siRNA成功载带进入细胞。 

目前的技术仅仅是利用乳化交联或者复凝聚法等传统方法制备壳聚糖纳米颗粒，制备的颗粒粒径很大，有些甚至达到微米级别，这样纳米颗粒的分散性和稳定性都不好，也不能长期存放，不然会发生严重的团聚；而且未经过处理的壳聚糖在生理条件下只是略微带正电荷（pKa=6.5），对RNA的吸附力不强，吸附量也不够。

发明内容

核酸药物是如今研究的热点，它能参与RNA干扰（RNAi）途径，干扰特定基因的表达，用于基因治疗。然而，由于siRNA的尺寸和带负电的特性，导致其难以进入细胞，因此如何载带它们进细胞始终是个难题。壳聚糖是一种生物安全性很好的天然高分子材料，用壳聚糖纳米颗粒作为核酸药物的载体是目前研究的热点，但是目前的技术都是利用乳化交联或者复凝聚法等制备壳聚糖纳米颗粒，其制备的颗粒粒径很大，有些甚至达到微米级别，这样纳米颗粒的分散性和稳定性都不好，也不能长期存放，不然会发生严重的团聚。

根据现有技术存在的缺陷，本发明的目的是利用一种新方法制备的壳聚糖纳米颗粒作为核酸药物载体的应用，该载体生物安全性好，可以吸附任何序列的siRNA，对核酸药物的研发起了十分重要的作用。该发明具有以下过程和步骤。

a. 将壳聚糖完全溶解于酸性溶液中进行质子化，后用乙醇将其沉淀出来研磨烘干待用。蛋白质加入到pH值7.0-10.0、10-50mM的缓冲溶液中， 加入上述质子化壳聚糖，壳聚糖中氨基葡萄糖单元与蛋白质的摩尔比为2000:1-10000:1，室温搅拌完全溶解后，加入戊二醛水溶液，戊二醛与氨基葡萄糖单元的摩尔比为0.35：1-0.7:1，室温搅拌至反应完全后，超滤洗涤三次（3000g，15min）以除去未反应的壳聚糖等，即可得包裹蛋白质的壳聚糖纳米颗粒。

b. RNA的载带：取上述壳聚糖纳米颗粒（NPs）与RNA在室温下混合均匀，与Hela细胞共培养6-48h，纳米颗粒的终浓度为10-200μg/mL，RNA终浓度为10-200nM，即质量比为0.06% -26.6%（RNA/NPs）。

与现有技术相比，本发明具有如下突出优点：

本发明的利用一种新方法制备的壳聚糖纳米颗粒吸附RNA，该方法得到了一种蛋白质-壳聚糖核壳结构的纳米颗粒，尺寸很小（20nm左右），具有很大的比表面积，分散性稳定性很好，并且表面带有大量正电荷（Zeta电势约 +38mV），可以在其表面吸附大量的siRNA，并载带siRNA成功进入细胞。 

附图说明

    图1为本发明所得壳聚糖纳米颗粒（包裹BSA）透射电子显微镜（TEM）图。

    图2为本发明所得壳聚糖纳米颗粒（包裹BSA）动态光散射（DLS）图。

图3为本发明所得壳聚糖纳米颗粒（0.5mg/mL）体外吸附RNA实验结果图。

图4  仅FAM-siRNA（FAM，发射波长520nm，绿色荧光）进Hela细胞图。

图5 为本发明所得壳聚糖纳米颗粒（100μg/mL）将FAM-siRNA载带进Hela细胞图（488nm激发）。