[发明专利]一种重组人谷丙转氨酶蛋白标准品和重组人谷草转氨酶蛋白标准品及其制备方法

权利要求书

1.一种重组人谷丙转氨酶蛋白标准品，其特征在于，编码所述的重组人谷丙转氨酶蛋白标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种重组人谷丙转氨酶蛋白标准品，其特征在于，所述重组人谷丙转氨酶蛋白标准品的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种重组人谷草转氨酶蛋白标准品，其特征在于，编码所述的重组人谷草转氨酶蛋白标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.一种重组人谷草转氨酶蛋白标准品，其特征在于，所述重组人谷草转氨酶蛋白标准品的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.一种重组基因表达载体，其特征在于，所述的重组基因表达载体含有权利要求1或权利要求3所述的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述的重组基因表达载体选自PRSF-Duet质粒。

7.根据权利要求6所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述的PRSF-Duet质粒在目的基因片段之前，插入6His标签。

8.一种基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌含有权利要求5～7任一权利要求所述的重组表达载体。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌选自大肠杆菌BL21菌株。

10.一种如权利要求1或3所述的重组人谷丙转氨酶蛋白标准品或重组人谷草转氨酶蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）目的基因的获得：查询人谷丙转氨酶蛋白和人谷草转氨酶蛋白的序列，根据大肠杆菌偏爱密码子表，对查找的序列进行优化，并进行合成；

（2）构建基因表达菌株：通过双酶切的方法将合成的基因从复制型载体上切下，连接入基因的表达载体PRSF-Duet，并将构建好的基因表达载体转化至大肠杆菌BL21菌体中，构建基因工程菌株；

（3）目的蛋白的表达与纯化：用IPTG诱导蛋白的表达，并对表达的蛋白进行纯化，获得人谷丙转氨酶蛋白和人谷草转氨酶蛋白，并对获得的谷丙转氨酶和谷草转氨酶蛋白进行活性的测定；

（4）基质血清的处理；

（5）重组人谷丙转氨酶蛋白标准品或重组人谷草转氨酶蛋白标准品的评价；

（6）重组人谷丙转氨酶蛋白标准品或重组人谷草转氨酶蛋白标准品的定值以及不确定度的评估。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，目的蛋白的诱导条件为：IPTG浓度为0.01～2.0mmol/L，诱导温度为15～35℃；优选为：2mmol/L，诱导温度为25℃。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，目的蛋白的纯化采用亲和层析和分子筛层析，所述的亲和层析优选镍离子亲和层析，所述的分子筛层析优选葡聚糖G50凝胶分子筛层析。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，蛋白纯化后，人谷丙转氨酶的蛋白活性为80000U/L，人谷草转氨酶蛋白的活性为136000U/L。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，基质血清的处理包括病原微生物的筛查和去除纤维蛋白原。

15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述的均匀性评价包括标准物质的瓶内均匀性评价和瓶间均匀性评价，标准物质的稳定性评价包括标准物质的冻融稳定性评价、4℃储存条件下稳定性评价、常温稳定性评价以及长期稳定性评价。

16.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤（6）中，测量得到谷丙转氨酶活性为1100.7U/L，不确定度为36.73U/L；谷草转氨酶活性为748.8U/L，不确定度为33.20U/L。