[发明专利]真核生物翻译起始因子4H（eIF4H）基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法能够在体外抑制小鼠血癌细胞的生长。该方法为白血病的发生和细胞分化机理的研究提供了新的视角，为抗肿瘤药物的研究提供了潜在的靶点。 

背景技术

白血病是一类严重的血液恶性肿瘤，在各类癌症中发病率较高。研究表明白血病的发生是造血祖细胞分化和凋亡紊乱所致。正常造血祖细胞程序性分化过程是受到一系列因子的严格调控，如果造血祖细胞失去了对调控因子的正常应答，就可能会引起细胞去分化和增殖失控。 

利用基因沉默的方法可在mRNA和蛋白质水平降低目的基因表达，从而下调肿瘤发生相关的一些基因的异常表达来达到治疗肿瘤的目的。真核生物翻译起始因子4H(eukaryotic translation initiation factor4H，eIF4H)是一个核糖体的翻译起始蛋白，可促进的蛋白质的合成。而对蛋白质合成的调控往往与细胞增殖、分化乃至肿瘤的发生密切相关，因此eIF4H是一个潜在抗肿瘤的治疗靶点。 

eIF4H在进化过程中具有高度的保守性，对基因和蛋白质同源性的研究发现人和鼠的亚型II的同源性分别为91.4%和99.1%。eIF4H通过选择性的剪接5位外显子产生两个蛋白亚型，亚型Ⅰ含248个氨基酸，约27kDa，亚型Ⅱ含228个氨基酸，约25kDa，在小鼠中两个亚型的表达量相近。eIF4H通过调控cyclin D1的表达来促进细胞增殖。在常见人肿瘤细胞中，eIF4H均有较高表达。 

慢病毒介导的RNA干扰技术可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，高效持久的实现特定基因的下调表达。含有干扰序列的慢病毒质粒载体可在宿主细胞内稳定表达小发夹结构的shRNA，shRNA在细胞内进一步加工成siRNAs，从而干扰目的基因，造成RNA水平上的基因沉默。 

本发明构建了针对eIF4H的RNA干扰质粒，通过与两个慢病毒包装质粒共转染人肾胚细胞293T细胞获得可使eIF4H低表达的慢病毒，慢病毒侵染鼠红白血病细胞MEL细胞系， 有效抑制了血癌细胞的生长，并可促进红系分化进程。 

发明内容

本发明以真核生物翻译起始因子4H（eIF4H）为靶基因，利用慢病毒介导的RNA干扰技术使该基因沉默，创建了一个有效的抑制体外肿瘤细胞生长的方法。 

本发明发现eIF4H在丁酸钠或六甲基烯二乙酰胺（HMBA）诱导MEL细胞红系分化过程中表达下调。在eIF4H基因的编码区选取翻译起始位点后的第179～199bp作为干扰靶位点，合成了可形成小发夹shRNA的寡聚核苷酸序列，通过分子生物学方法获得了含有该shRNA的真核干扰质粒。将干扰质粒与两个病毒包装质粒共同转染入人肾胚细胞293T细胞系以获得可使eIF4H低表达的慢病毒。然后将慢病毒侵染鼠红白血病MEL细胞，经嘌呤霉素筛选得到稳定株。蛋白质印迹分析技术显示，干扰细胞株中eIF4H蛋白表达量明显下降，表明eIF4H基因被有效的沉默了。通过MTT分析，发现低表达eIF4H的MEL细胞的生长速度明显低于对照组；利用流式细胞术分析了细胞周期，结果显示MEL细胞在eIF4H基因沉默后S期细胞减少，G₁期细胞增多；利用联苯胺染色对红系分化进行分析，eIF4H低表达促进MEL细胞红系分化进程。以上三个实验结果表明eIF4H基因沉默后，MEL细胞的增殖受到抑制。 

本发明提出的技术路线可以进一步应用于不同组织来源的肿瘤细胞和不同的肿瘤相关基因，可以用来研究肿瘤的发生机制，寻找用于抗肿瘤的基因治疗的理想靶点。 

附图说明：

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。 

图1：eIF4H在丁酸钠或HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中表达下调； 

图2：本发明中选择的干扰靶位点； 

图3：eIF4H基因沉默MEL细胞稳定株的建立； 

图4：eIF4H基因沉默后MEL细胞的生长速度明显低于对照组； 

图5：eIF4H基因沉默后MEL细胞中S期细胞减少，G₁期细胞增多； 

图6：eIF4H基因沉默后促进了MEL细胞的红系分化进程。 

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。 

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。 

实施例1 

免疫印迹法检测eIF4H在丁酸钠或HMBA处理的MEL细胞中的表达变化