[发明专利]一种胆固醇氧化酶产生菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胆固醇氧化酶产生菌的筛选方法，属于应用微生物技术领域。

背景技术

胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，COD，EC1.1.3.6)是一种单体双功能、以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的一类氧化还原酶。胆固醇氧化酶可以催化胆固醇环上的3β-羟基使其氧化，并完成中间产物胆甾-5-烯-3-酮向最终产物胆甾-4-烯-3-酮的异构化过程。

如今，胆固醇氧化酶凭借其简单、特异性强、灵敏度高的优势，已成为应用于临床(参与胆酸合成)最广泛的酶之一，在血液胆固醇检测和心脏病诊断方面尤为突出。另外，胆固醇氧化酶在农业中作为绿色杀虫剂也展现了巨大的潜力。

胆固醇氧化酶于1944年首次从Rhodococcus erythropolis中分离得到，随后发现许多革兰氏阳性、革兰氏阴性菌种都可以产生该酶，其中链霉菌属(Streptomyces sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)等菌种研究较为集中。

然而，一般野生型菌株的产酶能力较低(200U/L)，而且其培养条件(如pH、温度、发酵时间等)还远不适宜工业生产；另一方面，由于发酵生产过程中需要加入胆固醇作为诱导剂，而胆固醇水溶性极差，如何在培养基中均一且稳定地分散也是目前普遍面临的难题。因此，只有高效筛选出产酶量较高、工业生产潜力较大的野生型菌株，才能以一个较高的起点向后续的基因表达、分离纯化等方向继续攻坚克难。

发明内容

本发明的目的是针对目前筛选技术的不足环节，提供针对以胆固醇为唯一碳源且大量产生胆固醇氧化酶的菌株的一种高效准确的筛选方法。

解决上述问题的技术方案为：

1)初筛：将样品用无菌生理盐水稀释后，经过三到四次富集，再涂布于以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上，挑选能够产生棕红色的菌株；

2)复筛：将上述初筛菌株经活化后接种到发酵培养基中，30℃培养48h后测定胞外胆固

醇氧化酶活性。

所述初筛过程的富集培养基成分如下：磷酸氢二钾2.8528g L^-1，硫酸铵1.000g L^-1，磷酸氢二钠6.1242g L^-1，硫酸镁0.2500g L^-1，氯化钙0.0500g L^-1，胆固醇1.5466g L^-1，Tween-800.773mL L^-1，pH6.5。

所述初筛过程的筛选固体培养基成分如下：磷酸氢二钾2.8528g L^-1，硫酸铵1.000g L^-1，磷酸氢二钠6.1242g L^-1，硫酸镁0.2500g L^-1，氯化钙0.0500g L^-1，胆固醇1.5466g L^-1，Tween-800.773mL L^-1，琼脂25g L^-1，邻联茴香胺(简称DA)0.1000g L^-1，辣根过氧化物酶(简称HRP)1000U，pH6.5。

所述复筛过程的发酵培养基成分如下：葡萄糖10g L^-1，胰蛋白胨10g L^-1，酵母膏5g L^-1，胆固醇2g L^-1，Tween-801mL L^-1，pH6.5。

所述复筛过程的酶活测定体系成分如下：2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称ABTS)与HRP混合液3mL，胆固醇工作液200μL，粗酶液50μL。

所述ABTS-HRP混合液配制如下：称取0.0183gABTS和0.0021g HRP(250U/mg)，用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.2)溶解，定容至100mL。

所述胆固醇工作液配制如下：称取0.0190胆固醇粉末溶解于脱氧胆酸钠溶液(5％w/v)中，定容至10mL。

本发明具有如下优点：

1)筛选方法高效准确，能够获得高产胆固醇氧化酶的菌株；

2)本发明的酶活测定方法，操作简便迅速、灵敏度高，同时保证了测定过程中的安全性。

具体实施方式