[发明专利]重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达；

破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一；

将所述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1~4：1~5，在4~8℃的温度下振荡1~2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液；

将所述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理，得到所述沉淀物一的溶解液；将所述沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1~4：1~5，在4~8℃的温度下振荡1~2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液，其中，所述沉淀物一洗涤步骤使用包涵体洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液包含50~60mmol/L Tris-HCl，90~100mmol/L NaCl，0.5~1mmol/L 乙二胺四乙酸，7~8 mmol/L聚乙二醇辛基苯基醚，pH8.0~8.2；

将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白；

所述树脂悬液为50%的Ni-NTA-His•Bind树脂悬液；所述结合缓冲液为Ni-NTA结合缓冲液，所述Ni-NTA结合缓冲液中的咪唑浓度为0~10 mM/L，pH值为7~8。

2.根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述漂洗步骤使用Ni-NTA漂洗缓冲液，所述Ni-NTA漂洗缓冲液中的咪唑浓度为20~60 mM/L，pH值为7~8；所述洗脱步骤使用Ni-NTA洗脱缓冲液，所述Ni-NTA洗脱缓冲液中的咪唑浓度为200~300 mM/L，pH值为7~8。

3.根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述淀物一经洗涤后用包涵体溶解缓冲液重悬，所述包涵体溶解缓冲液包含500~600mmol/L的3-(环己胺)-1-丙磺酸盐、10~15mmol/L 的N-十二烷基肌氨酸钠和0.8~1mmol/L的二硫苏糖醇，pH值为10~11。

4.根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述透析步骤为将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液和包涵体中重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液加入至透析液中，在4~8℃的温度下透析3~4小时；所述透析缓冲液包含0.01~0.02mol/L的 Tris-HCl、0.05~0.1mmol/L的二硫苏糖醇，pH值为8.2~8.5。

5.根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述破碎经诱导表达后的重组菌的方法为直接破碎或复合破碎；其中，所述复合破碎的方法为：将所述经诱导表达后的重组菌在-4~-20℃的温度下冻融2~4次，加入抽提试剂，在20~25℃的温度下重悬，振荡孵育30~60分钟；其中所述抽提试剂体积与所述经诱导表达后的重组菌的质量比为5~10ml/g。

6.根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌的方法如下：

合成含有6× His Tag序列的植原体免疫主导膜蛋白基因，设计引物对，扩增所述植原体免疫主导膜蛋白基因；

将所述植原体免疫主导膜蛋白基因克隆至表达质粒上，得到重组质粒；

用所述重组质粒转化感受态大肠杆菌，得到表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述引物对为引物对一、引物对二、引物对三中的任一种；其中，所述引物对一包含上游引物 F'5'-ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CGCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物对二包含上游引物F'5'-CGCCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CCCCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物对三包含上游引物F'5'-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CCCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。