[发明专利]一种快速制备植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶多克隆抗体的方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶原核表达载体的构建、表达、纯化技术以及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶（LRR-RLK）是植物基因组中已知的最大的一类跨膜类受体激酶亚家族，在拟南芥中已经鉴别出这类基因亚家族的216个成员，水稻中已鉴别出300多个成员。LRR-RLK的胞外富含亮氨酸结构域与胞外的信号分子如离子、化学小分子或多肽等的特异性结合后，激活胞内激酶结构域的互磷酸化和自磷酸化的活性，从而参与一系列的生物学过程。

此类基因的结构由胞外LRR结构域，单跨膜区以及胞内激酶结构域3部分组成。LRR-RLK在细胞内的广泛分布及结构特点决定了其功能的重要性。该家族基因参与植物的生长发育，它们分别在器官大小和形态控制，器官脱落，配子体发育，划分和柱头的识别以及体细胞胚胎发生的生物过程中起重要的作用。并且该家族的一些基因还参与植物激素的信号转导，包括油菜素甾醇(BR)，脱落酸(ABA)以及植物硫肽激素(PSK)等。此外，该家族成员还广泛参与植物的防御和对病原微生物的识别，其中具有抗病功能的FLS2以及植物免疫抗性相关基因Xa21等研究的较为清楚。因此，植物通过该家族的富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶感知胞外信号，然后通过胞内的激酶结构域传递信号到细胞内，从而指导植物对胞外的信号作出相应的反应。就像动物一样，植物通过受体开启错综复杂的信号通路，信号通路间可以相互作用或者形成反馈环使多个复杂的单元联合在一起指导目标基因的转录。

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系（克隆）。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。

传统用短肽制备的单个抗原表位的抗体存在长度短，体内容易降解及免疫原性较弱等问题。因此我们选择利用植物全长蛋白来免疫制备相应的多克隆抗体，可以获得多抗原表位，且稳定高效的植物抗体，在生产实验中广泛得到应用。

抗体制备过程中常用的技术方法要点如下：

动物的选择：可作为免疫的选择对象有家兔、山羊或绵羊、马和豚鼠等实验动物。动物种类的选择主要是根据抗原的特性和所要获得抗体的量和用途。如马匹常用于制备大量抗毒素血清；豚鼠适用于制备抗酶类抗体和补体结合试验用的抗体，但抗血清产量较少。对蛋白质抗原，大部分动物均适合，常用的是家兔和山羊；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性，每批免疫宜同时使用数只动物。

抗原种类（或类型）的选择：根据所制备抗血清的用途选用不同类型的抗原，如制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀，最好选用降解的蛋白质抗原，而用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀，最好选用自然的蛋白质抗原。若制备抗独特型抗体，所用抗原可以是可溶性Ig分子，或者是完整的细胞，也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。

抗原剂量的选择：病原生物抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等的不同而异。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。一般而言，小鼠首次抗原剂量为50～400ug/次；大鼠为100ug～1mg/次；兔为200ug～1mg/次，加强免疫剂最为首次剂量的1/5～2/5。