[发明专利]H7N9亚型禽流感病毒快速检测引物组及其用途

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断和基因诊断领域，为微生物检测试剂，试剂检测对象H7N9亚型禽流感病毒RNA。

背景技术

H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。

此次报道的人感染H7N9禽流感病毒，是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，至2013年4月尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。2013年4月经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。

目前，H7N9禽流感病毒感染的诊断，主要根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可以做出人感染H7N9禽流感的诊断。特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，均可以作为诊断标准。然而，目前相关检测技术存在一定程度的弊端：虽然病毒分离属于诊断的金标准，但是该方法只能在BSL-3级实验室进行，且容易造成对操作人员直接接触感染的可能，不利于普及和推广。此外还有基于PCR技术的相关检测方法，该技术具有操作复杂、检测成本较高无形中加重了患者负担、对于操作人员要求较高、不利于在基层医院开展等缺点。此外，根据PCR技术的原理，需要有变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的反应温度和时间均不相同且有十分精确的要求，甚至需要进行20-40个循环来完成，因此需要依赖相对贵重的PCR温度循环仪进行控制，不利于现场诊断的要求。核酸序列扩增法(NASBA)，自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)虽然属于等温扩增法，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要后续的实验操作手段来对于扩增产物进行检测，因此具有操作繁琐的缺点。在病原体集中爆发期间，由于单克隆抗体获得周期较长，不利于在疾病爆发期间进行检测。

为了改善目前H7N9检测操作复杂、依赖昂贵的仪器设备、检测成本高、对操作人员要求较高等缺点，开发一种能够不依赖于昂贵的仪器设备，能够在1小时内对患者样本进行检测，并且可以用肉眼直接观察结果的H7N9检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检准率高特点，使其反应程序化，能够广泛应用于临床检验及流行病学调查。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA，Nucleic Acids Res.2000Jun15；28(12)：E63.)。该技术具有以下优点：(1)特异性强，PCR反应仅需要一对引物来识别靶DNA，达到分子检测的目的，而LAMP技术使用2对引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，因此特异性较高；(2)灵敏度高，由于该技术使用了一种灵敏度、扩增效率高的DNA聚合酶，因此大大提高了灵敏度，并且缩短了检测时间；(3)操作简单，是用肉眼对结果就能进行判断，并且在等温条件下反应，操作简便不依赖贵重仪器设备。

因此本发明利用了该技术的上述优点，将其应用于H7N9禽流感病毒的检测，能够改善目前众多技术的不足。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，通过以下技术方案实现了高效、特异性检测H7N9禽流感病毒的目的。

本发明的一个技术方案如下：

一组用于检测H7N9亚型禽流感病毒的引物组，其包含以下引物：

(1)针对H7亚型进行检测的各引物如下：

外引物1：GAAGAAGCTCTGAGGCAA

外引物2：CTTAGTCATCTGCGGGAA

内引物1：

TGCTCCATTAGTTCTTATTCCACTGATTCTCAGAGAATCAGGCG