[发明专利]一种重组噬菌体双表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体双表达载体及其应用。

背景技术

T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，基因组为线状双链DNA，长39 936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白(P10A)、次要头蛋白(P10B)、颈圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾丝蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10编码的是一对重叠蛋白，P10A有344个氨基酸残基，P10B有397个氨基酸残基，是在P10A的phe341处翻译移码产生的，在野生型T7噬菌体中，P10B约占衣壳蛋白总量(415拷贝)的10%。T7噬菌体展示系统是一种新型的展示系统，对p10进行了改造，自然状态下的翻译移码位点被去除，并在348位氨基酸之后重组入了一个多克隆位点，使得基因组中仅表达改造后的P10B (415拷贝)，因而可以将外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。利用噬菌体作为抗原表位的载体，其表面展示的多肽是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；噬菌体有较强的免疫原性，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；由于噬菌体颗粒是由感染的细菌分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；噬菌体生长迅速，纯化简单、花费少；噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。

但是，以表面展示有抗原表位的噬菌体颗粒作为抗原制备的疫苗，其免疫效果也不能令人满意。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组噬菌体双表达载体，利用T7噬菌体的生物学特性，将其作为半抗原的表达和递呈载体又作为DNA疫苗的转运载体，实现外源基因在真、原核条件下的双表达，该方法操作简单，稳定性高，可作为外源基因表达的通用平台。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种重组噬菌体双表达载体，是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体。

所述重组噬菌体双表达载体的表面展示有目的基因1编码的多肽，同时又能在免疫细胞内真核表达目的基因2编码的多肽。

所述真核表达盒含有CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴。

所述T7噬菌体基因组中非编码区为T7噬菌体基因组左侧578-2746位的区域。

所述目的基因1为（1）或（2）或（3）的核苷酸序列：

（1）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列；

（2）编码在口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽氨基端添加了柔性Linker氨基酸后所得多肽的核苷酸序列；

（3）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1（129-169）位多肽的主要抗原活性的核苷酸序列。

所述目的基因2为（4）或（5）的核苷酸序列：

（4）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示；

（5）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1结构蛋白的主要抗原活性的核苷酸序列。

在T7噬菌体非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒的具体方法为：

在T7噬菌体的非编码区选择插入位点，分别PCR扩增该插入位点上、下游基因序列作为左、右同源臂，构建自上游到下游依次含有左同源臂和右同源臂的重组克隆载体；

将目的基因2插入CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴之间，得到真核表达盒；

将所述真核表达盒插入所述重组克隆载体的左、右同源臂之间，得到同源重组质粒；

所述同源重组质粒与T7噬菌体基因组进行同源重组，得到非编码区插入了含有目的基因2的真核表达盒的重组T7噬菌体。

一种以所述重组噬菌体双表达载体为抗原的疫苗。

本发明具有如下技术效果：

本发明重组噬菌体双表达载体，稳定性高，能够在噬菌体表面展示目的基因1编码的蛋白，同时能够将真核表达盒运到免疫细胞内部，实现目的基因2的真核表达，可作为各种抗原表位多肽表达的通用平台。