[发明专利]植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的领域。更具体地，本发明涉及遗传构建体，其被设计用来在植物中表达蚜虫基因的dsRNA。这些构建体可被用于产生转基因植物，对取食该植物的蚜虫具有潜在的抑制或杀伤作用。

背景技术

蚜虫危害棉花、小麦、油菜等多种作物。化学杀虫剂是目前主要的控制手段。但化学杀虫剂存在副作用，它们不仅污染环境，也没有特异性，除了对蚜虫杀伤外，也会对作物及其它昆虫造成伤害。化学杀虫剂在环境中代谢缓慢，会进入食物链中，在高级的捕食物种中积累，并产生毒性。

因为生物杀虫剂可以避免化学杀虫剂的这些危险，而受到青睐。例如，Bacillus thuringiensis(B.t.)细菌作为一种环境安全的生物杀虫剂已经市场化应用超过30年了。生物杀虫剂除了能保持土壤和水清洁外，也会因化学杀虫剂使用量的降低而使田间有益昆虫的数量增加。

RNAi对靶基因mRNA抑制的特异性和高效性使之成为一种控制基因表达的有力工具。RNAi是由小干扰RNA（siRNA）介导的序列特异性的转录后基因沉默过程。RNAi由dsRNA触发，细胞中的dsRNA被Dicer核酸酶水解为21～23nt的siRNA，siRNA再引导核酸内切酶对细胞内的与之序列配对的mRNA进行降解。有些动物的消化道可以吸收来自食物的dsRNA，并诱导消化道细胞产生RNAi现象，或进一步地引起系统性的基因沉默。通过饲喂表达dsRNA的细菌，以成功建立了线虫基因沉默的方法。如果dsRNA引发沉默的基因是害虫生存所必需的，则该dsRNA就可能研制为杀虫剂。

dsRNA能否达到杀虫的效果，与dsRNA能否被昆虫中肠有效吸收和在昆虫细胞中能否引发强烈的RNAi效应有关。为此，dsRNA首先必须在昆虫中肠达到较高的浓度。本发明提供了一种RNAi载体，可以使转基因植物在韧皮组织中表达棉蚜的dsRNA和ToMV的CP蛋白，该dsRNA由于包含OAS而可以被CP包装，从而降低在消化道的降解，在中肠形成较高的浓度。

发明内容

本发明提供了一种植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用。

一种植物表达载体，用于构建dsRNA植物表达载体，dsRNA序列与番茄花叶病毒（ToMV）的起始组装序列（original assembly sequence，OAS）相连，因此转录的RNA分子能够被ToMV的外壳蛋白（CP）所包装；所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框架，其编码的CP能包装含OAS的RNA分子，dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下，使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。

将棉蚜靶标基因序列与ToMV的OAS相连，并同时表达ToMV的CP蛋白；CP蛋白可以识别OAS，并从OAS开始对RNA包装；蛋白质的包装可以降低RNA与RNA酶的接触，从而减少降解的风险；另外，蚜虫取食于植物的筛管，本发明用韧皮部特异性的启动子使RNA和CP能在筛管中形成较高的浓度，而在其它组织中表达很低。

本发明载体在OAS两侧提供了两组由同尾酶（XbaI/AvrII和XmaI/BspEII）组成的插入位点，当靶标序列的两侧分别为XbaI和XmaI及其同尾酶时，均可被克隆到上述两个位点。

本发明载体以pCAMBIA2300为骨架，可以用农杆菌介导法对目标植物进行转化，转化细胞用卡那霉素筛选。

在实施例中，用于产生dsRNA的靶标序列是从棉蚜中分离的V-型质子泵ATPase的A亚基基因的同源片段。但靶标序列可以不限于该基因以及棉蚜。

本发明载体中，dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累。其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳虫等。

附图说明

图1为pBiRolCPOAS载体图；

图2为PRNAiAV2载体图；

图3为PCR产物电泳；

图4转基因拟南芥抑制取食棉蚜AV2基因的表达。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：载体构建所需DNA片段的制备