[发明专利]一种单、双光子线粒体荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种线粒体荧光探针及其应用，尤其涉及一种吡啶阳离子类化合物的单、双光子线粒体荧光探针及其应用。

背景技术

线粒体是真核细胞内具有重要生理功能的细胞器之一，是细胞进行呼吸作用产生能量的重要场所。同时研究发现，线粒体的数量、分布与细胞生命活动的旺盛程度密切相关，在细胞增殖、分化、细胞间信号传导、细胞内自由基生成等生理活动中起到重要作用；并与癌症，老年痴呆等疾病关系密切。因此，开发新型细胞内线粒体荧光探针成像，并给出细胞内线粒体数量和分布的信息，有着重要的生命科学与医学价值。

一般来说，观测细胞内分子荧光成像的仪器有激光扫描共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜，其中双光子荧光显微镜在成像活细胞方面的优势更为明显。然而，由于单、双光子吸收遵循不同的选率，能用于单光子荧光成像的探针有时并不适用于双光子荧光显微镜。所以，目前适合双光子显微镜使用的、能在活细胞内高选择性标记线粒体内的荧光探针十分缺乏。因此，对能在活细胞内使用并具有高线粒体定位能力和良好双光子性能的荧光探针的研究迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种吡啶阳离子类化合物的单、双光子线粒体荧光探针及其应用。

本发明所述的单、双光子线粒体荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是通式（I）所示结构的化合物，

其中：上述R₁表示烷基或羟烷基，R₂表示乙酰基或氢。

上述的单、双光子线粒体荧光探针中：所述R₁优选C_1-6的烷基，R₂优选乙酰基或氢。

进一步的优选，所述R₁表示C_1-3的烷基，R₂表示乙酰基。

本发明所述单、双光子线粒体荧光探针最优选是4-(2-(6-乙酰基-9-乙基咔唑-3-)-乙烯基)-己基吡啶碘盐。

上述单、双光子线粒体荧光探针化合物制备方法概述如下：

为了增加分子在生理环境下的适应性，发明人首先在咔唑氮上引入乙基、丁基或羟乙基，然后利用F-C反应合成了相应乙酰基咔唑，然后将乙酰基咔唑溴化，再进行Heck反应，最后将吡啶离子化，得到最终产物吡啶盐类化合物，其中：所述吡啶盐类化合物优选是4-(2-(6-乙酰基-9-乙基咔唑-3-)-乙烯基)-己基吡啶碘盐。

上述吡啶盐类化合物的制备反应式如下：

本发明所述单、双光子线粒体荧光探针在标记或显示线粒体在活细胞中分布的应用。

其中：所述活细胞为HeLa或SiHa细胞。

试验结果证实，本发明所述荧光探针能够在活细胞中高选择性标记线粒体，为线粒体相关的病理学研究提供了简捷、直观的生物检测试剂。也预示本发明所述吡啶盐类化合物作为双光子线粒体荧光探针具有广泛的应用。

大量的实验证明：本发明的吡啶盐类化合物是一类新型的高选择性标记线粒体荧光探针分子，与其功能相近的线粒体荧光探针比，本发明所述吡啶盐类化合物具有价格低、双光子性能好、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。本发明的吡啶盐类化合物还具有高的线粒体定位能力和双光子荧光活性吸收截面大的特点，并且本荧光探针和Hochest33342、MTR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：4-(2-(6-乙酰基-9-乙基咔唑-3-)-乙烯基)-己基吡啶碘盐对活性SiHa细胞进行染色在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为用4-(2-(6-乙酰基-9-乙基咔唑-3-)-乙烯基)-己基吡啶碘盐染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图。

图2：4-(2-(6-乙酰基-9-乙基咔唑-3-)-乙烯基)-己基吡啶碘盐和线粒体红依次对活性SiHa细胞进行染色后，分别在405和561纳米激光辐照下分为三个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中a图为405纳米激发绿色通道的照片，b为561纳米激发红色通道的照片，c为a、b合并图片，d图为c图中细胞放大照片，e图为d图中画线位置两个通道中荧光强度分布图。