[发明专利]脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种色谱纯化方法，特别涉及一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法。

背景技术

氨基酰化是常见的蛋白修饰方法，酰化的通用方法常见于C.H.W.Hirs主编的由Elsevier出版的《酶学方法》，25:494-499（1972）。

目前丹麦诺和诺德公司出产的地特胰岛素即是常见的利用该原理在B29位Lys残基的ε-氨基酰化修饰后得到的胰岛素衍生物。而在胰岛素的氨基酰化反应中，目前业内一般使用活性酯、酰卤或酸酐，与胰岛素原或类似物反应制备单酰化胰岛素，但由于胰岛素原或类似物中含有位于A1、B1位置的氨基酸的游离α-氨基和其他氨基酸侧链上的游离ε-氨基（比如Lys的ε-氨基），这三种游离氨基皆可以与活性酯、酰卤或酸酐形成共价键结合，从而形成了以上常见的不同位点修饰的单取代胰岛素或者双取代胰岛素蛋白产物。因此，如何能够较好地选择性修饰胰岛素及其后续纯化便成为了重要难题。在生物学杂志Biochem.J121：737-745（1971）刊登的The acylation of insulin一文中Lindsay等提供了胰岛素和乙酸N-琥珀酰亚胺酯反应的实验数据，主要生成了Phe^B1-乙酰基单取代胰岛素、Gly^A1-乙酰基单取代胰岛素、Lys^B29-单取代乙酰基胰岛素及少量双取代胰岛素，之后其采用DEAE离子交换填料研究产物的纯化研究。发现使用该方法具有一定的纯化效果但并不如人意，因为尽管其文献上纯度结果显示能够达到90%以上，但由于在纯度结果判定方法上，Lindsay只是使用了等电凝胶电泳方法作为检测方法，而该方法与目前业界中常用的HPLC方法相比较，灵敏度低。在protein&peptide letters,13:135-142（2006）刊出的Synthesis，Characterization and Biological Activity of Chemically Modified Insulin DerivativeWith Alpha Lipoic Acid一文中，Tao Huang等采用硫辛酰苯并三唑与人胰岛素在碱性条件下反应，生成了以ε-Lys^B29-lipoyl-insulin为主的单酰化修饰产物。之后，其主要运用了以C18反相硅胶为固定相的RP-HPLC进行纯化，得到了纯度高于95%的单酰化胰岛素。中国专利CN1171742提供了一种选择性反应酰化修饰人胰岛素原及其类似物的ε-氨基的方法，在该专利申请中，其采用了以C4反相硅胶为固定相的RP-HPLC或者半制备柱，流动相为含0.1%TFA、乙腈和水的溶剂系统进行梯度洗脱的方法，并于53%乙腈浓度时得到单酰化胰岛素（纯度数据未披露）。

由此可见，目前对于酰化修饰后的胰岛素更多的是采用RP-HPLC或者高压制备液相在反相硅胶固体基质上进行液相分离纯化。术语RP-HPLC是指在高效液相仪器上采用反相固定相分离纯化的方法，高压制备液相是指在高压下（一般使用压力在5-15Mpa）运行的液相色谱。而反相硅胶则应理解为憎水基质已涂覆在上面的氧化硅材料，其中憎水基质例子为链长为C3-C20、特别是C4-C18的烷烃。

虽然采用在HPLC或者高压制备液相上用反相硅胶材料作为固定相可以达到较高的分离纯度，但该方法具有一些明显的缺点。比如反相硅胶仅在pH2-10范围内稳定，而脂肪酸酰化修饰胰岛素时容易产生大量疏水性很强的杂质，例如游离脂肪酸或脂肪酸修饰的二聚体或多聚体，他们在硅胶上容易吸附的很牢，且皆不容易被常规的再生洗脱，随着时间的延长，杂质容易在填料上浓缩。只能采用碱洗方法清洗，但是碱液容易破坏反相硅胶的化学性质进而影响填料的分离效果。同时，如果采用RP-HPLC或者高压半制备液相仪器作为分离纯化仪器，虽然其具有精确高效的特点，但是其成本高维护麻烦，尤其是成本至少要比中低压层析系统高出50%。

发明内容

为克服上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供以一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法。该纯化方法是运用一种比反相硅胶更方便使用、廉价的色谱材料，并在其上色谱纯化酰化修饰胰岛素。使用该法可以达到使用一步色谱纯化即可得到高纯度的酰化修饰胰岛素。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，包含如下步骤：利用中低压色谱系统对脂肪酸单酰化胰岛素进行分离，使用有机聚合物反相色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质、pH值为2～4；