[发明专利]一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶有效

专利信息
申请号: 201310256580.6 申请日: 2013-06-25
公开(公告)号: CN103305491A 公开(公告)日: 2013-09-18
发明(设计)人: 肖敏;卢丽丽;郭玉川 申请(专利权)人: 山东大学
主分类号: C12N9/42 分类号: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
代理公司: 济南金迪知识产权代理有限公司 37219 代理人: 朱家富
地址: 250100 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 能糖基化白 藜芦 半乳糖
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶,属于酶蛋白工程技术领域。

技术背景

化学法和酶法是目前进行糖基化修饰、糖苷合成的两大方法。糖类分子上多个可以反应的羟基,使得化学法糖基化必须进行复杂的基团保护及糖苷合成后的去保护,才能在立体构象和区域位置上特异性合成糖苷键,如此繁琐的步骤大大限制了其工业化合成糖苷的实用性。相比而言,酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性,步骤简单,环境友好。目前有两类酶可用于糖苷合成,即糖基转移酶(glycosyltransferase;EC2.4)和糖苷水解酶(简称糖苷酶glycosidase;EC3.2.1)。与糖基转移酶相比,糖苷酶较易获得、价格低,而且不需要糖基转移酶所用的贵重的核苷酸活化或磷酸长萜醇活化形式的糖基供体,所以工业化的实用性优于糖基转移酶。

酚类化合物具有非常重要的药理学活性,其糖基化修饰意义重大,但由于酚类化合物苯环羟基亲核性较低,天然糖苷酶以酚类化合物为受体进行糖基化修饰难度较大,多羟基酚类的酶法修饰尤其困难。目前国际上仅报道有来源于黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)能对芳香环羟基进行α-葡萄糖基化(糖基供体为麦芽糖),改善化合物水溶性和气味等,转糖基受体非常有限,仅报道有对苯二酚、儿茶酚和子丁香酚。其他糖基化修饰即半乳糖基修饰仅有一例报道,采用的酶源为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23),糖基化受体仅局限于对苯二酚。

发明内容

本发明针对现有技术的不足,提供一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶。

一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶来源于GenBank登录号为ACE06986.1的β-半乳糖苷酶,通过定向进化获得氨基酸和转糖基性质的改变。

一种编码能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的基因,核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组载体,在表达载体中插入了上述编码能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的基因。

优选的,所述表达载体为pBAD/his表达载体。

一种重组细胞,含有上述表达载体。

优选的,所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌LGM194后获得。

上述能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的制备方法:

人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank登录号为ACE06986.1),采用易错PCR进行随机突变,突变后的PCR产物连接到pBAD/his表达质粒上,转化大肠杆菌LGM194,筛选并获得能糖基化白藜芦醇的重组子,突变酶经测序获得具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。按照pBAD/his表达系统说明书制备能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶。

上述能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶在糖基化白藜芦醇中的应用,步骤如下:

(1)采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M~0.3M,丙酮配制的白藜芦醇浓度为0.05M~0.2M,氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg~10μg/mL的反应体系;

(2)将步骤(1)制得反应体系于37~45℃水浴中反应20~60分钟,煮沸终止反应,10000~12000转/分钟离心20分钟,取上清液;

(3)将步骤(2)制得的上清液,经分离、干燥后,制得白藜芦醇糖苷化合物。

根据本发明优选的,所述步骤(1)中的磷酸缓冲液为浓度10~100mM,pH6~8的磷酸钾缓冲溶液;根据本发明进一步优选的,所述步骤(1)中的缓冲液为50mM,pH7.0的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的,所述步骤(2)中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。

根据本发明优选的,所述步骤(2)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

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