[发明专利]咖啡酸糖苷衍生物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及咖啡酸糖苷衍生物及其制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶突变酶合成咖啡酸半乳糖苷的方法，属于糖工程技术领域。

技术背景

咖啡酸(Caffeic acid)属于多羟基酚酸类化合物，广泛分布在植物中，具有保护心血管、抗诱变抗癌、抗菌、抗病毒、降脂、降糖、抗白血病、免疫调节、利胆止血及抗氧化等药理作用。咖啡酸衍生物是近年来新药研发的热点化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和免疫调节等多方面的药理作用。目前获得的咖啡酸衍生物大都采用化学法合成获得，生物酶法修饰仅有3例，涉及到的酶源分别为葡萄糖基转移酶、α-淀粉酶和蔗糖磷酸化酶，均进行转葡萄糖基反应。

尽管酶法进行咖啡酸修饰步骤少，工艺简单，清洁无污染，但目前发现的能以咖啡酸为底物进行糖基化修饰的天然酶类非常有限，所获得的糖苷类衍生物仅局限于葡萄糖基修饰。目前尚无酶法半乳糖基化修饰咖啡酸的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供新型咖啡酸半乳糖苷及其制备方法。

一种咖啡酸半乳糖苷混合物，有效成分为咖啡酸3′-O-β-D-吡喃半乳糖苷和咖啡酸4′-O-β-D-吡喃半乳糖苷，分子式为C₁₅H₁₈O₉，咖啡酸3′-O-β-D-吡喃半乳糖苷的化学结构式如下：

咖啡酸4′-O-β-D-吡喃半乳糖苷的化学结构式如下：

根据本发明优选的，所述的混合物中咖啡酸3′-O-β-D-吡喃半乳糖苷与咖啡酸4′-O-β-D-吡喃半乳糖苷的质量比为1:3。

上述咖啡酸半乳糖苷混合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，咖啡酸浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；

（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；

（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得咖啡酸半乳糖苷。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶选用GenBank登录号为ACE06986.1，将第980位色氨酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备酶蛋白。上述β-半乳糖苷酶对咖啡酸具有显著转糖基活性。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离为用规格15mm×100cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，收集洗脱样品。

根据本发明进一步优选的，上述色谱分离的样品上样量为1～2mL，洗脱流速为0.2～0.3mL/分钟；最优的样品上样量为1mL，洗脱流速为0.2mL/分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离后的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。

上述薄层层析检测的步骤如下：

取1μL洗脱液，薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。

上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。

有益效果