[发明专利]一种人凝血因子Ⅷ的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备方法。

背景技术

甲型血友病又称为抗血友病球蛋白缺乏症或第Ⅷ因子缺乏症，是一种由于基因缺陷引起的凝血功能障碍性遗传病。患者多为男性，病人因体内缺乏凝血因子Ⅷ而经常发生内出血，仅靠自身机能难以止血。

凝血因子Ⅷ是一种血浆高分子糖蛋白，由2332个氨基酸残基组成，在内源性凝血体系中起了十分重要的作用，是激活凝血因子IX的辅助因子。凝血因子Ⅷ替代疗法是治疗甲型血友病及预防急性出血发作最有效的措施，常用的替代品包括血浆、浓缩凝血因子Ⅷ及重组凝血因子Ⅷ等。

按我国现有甲型血友病患者5-10万计算，每年维持国内患者治疗至少需要人凝血因子Ⅷ制品约80万瓶（200IU/瓶），每年缺口约40万瓶（200IU/瓶）。尽管目前市场上有进口基因重组凝血因子Ⅷ产品，但其价格是国内血浆类产品的4倍。

国内大多数厂家在制备人凝血因子Ⅷ的过程中，使用柱层析，成本高。此外，使用氢氧化铝进行沉淀，容易导致最终产品中残留铝。

因此，本领域需要开发出一种低成本、高收率的人凝血因子Ⅷ制备方法，简单可行，且能规模生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人凝血因子Ⅷ的制备方法。

本发明的第一方面，提供一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将冷沉淀用40-80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6.1-6.5，溶液温度维持在20-35℃；

(b)将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为2.5%-4.5%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20-30℃；

(c)对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液；

(d)将磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得到混合溶液，并对所述混合溶液进行灭活；

(e)将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为10%-14%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10-20℃；

(f)对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀；

(g)对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于1.5-2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌后进行离心；

(h)将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子Ⅷ，其中，每10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4.5-8.5克及甘氨酸70-110克。

在另一优选例中，所述肝素钠溶解液的重量是所述冷沉淀的重量的1-4倍。

在另一优选例中，所述步骤a)中所述冷沉淀的溶解过程中，溶液的温度控制在25-32℃。

在另一优选例中，所述步骤a)中，采用0.1-0.5mol/L盐酸调节pH值至6.1-6.5。

在另一优选例中，所述步骤b)中加入20-40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地，加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，最佳地，加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液。

在另一优选例中，所述步骤c)中离心分离流量为20-50L/hr，离心出液温度为12-17℃。

在另一优选例中，所述步骤d)获得的混合溶液中磷酸三丁酯的浓度为0.3vol%，聚山梨酯-80的浓度为1.0vol%。

在另一优选例中，所述步骤d)中将所述混合溶液置于24-26℃持续6hr，对所述混合溶液进行灭活。

在另一优选例中，所述步骤e)中加入20-40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地，所述步骤e)中加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，最佳地，加入30%的聚乙二醇溶液。

在另一优选例中，所述步骤f)中离心分离流量为40-70L/hr，离心出液温度为7-12℃。

在另一优选例中，步骤g)中，按1：15-1：20的比例(即1重量份沉淀加入15-20重量份1.5-2.5M甘氨酸洗涤液)将所述沉淀充分溶解于1.5-2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌30-60分钟使沉淀得到充分溶解，搅拌使洗涤充分，之后于6-11℃以3000-5000转/分钟的离心速度离心10-25分钟获得洗涤后的沉淀。本发明中所述甘氨酸洗涤液优选为甘氨酸的水溶液。