[发明专利]一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备玉米蛋白活性肽的方法，属于固定化酶技术应用领域。

背景技术

玉米醇溶蛋白是玉米加工主要副产物—玉米蛋白粉中的主要组成部分，约占68%,是一种结构特殊的蛋白质，其中的赖氨酸和色氨酸含量极少。由于含有高比例的非极性氨基酸残基，缺乏碱性、酸性氨基酸，使玉米醇溶蛋白不溶于水，加之其口感粗糙，因而限制了其在食品工业中的应用。

玉米肽是指玉米蛋白经蛋白酶降解后，再经分离、精制等过程得到的蛋白水解产物，它是由分子量小、活性高的短肽组成，富含谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，这种特殊的氨基酸组成使玉米肽具有特殊的理化性质如粘度随温度变化不大、溶解性好、持水性高、酸性条件下不易凝聚、较强的乳化性和起泡性、稳定性好等和多种生物学功能如降血压、醒酒、消除疲劳、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等作用。因此玉米醇溶蛋白降解制备玉米肽成为研究热点。

目前，酶解法是制备玉米肽的主要生产方法。关于酶解法制备玉米肽的现有技术中多采用游离单一或游离复合酶及单一载体固定单一酶法（海藻酸钠为载体固定单一蛋白酶）。游离蛋白酶在有机介质中容易失活,且酶蛋白难以回收，不仅增加了制备过程的成本，且造成后续产物分离纯化困难，不能规模化应用在实际工业生产中；单酶水解（游离单一或单一载体固定单一酶法）玉米醇溶蛋白存在水解不充分、水解度低等问题；玉米醇溶蛋白属于高憎水蛋白，在水相中溶解度低，耗酶量大，且水解效率低；在海藻酸钠为载体固定单一蛋白酶技术中，利用海藻酸钠单一载体所得凝胶珠在含多价阴离子的溶液以及高浓度电解质溶液中不稳定，钙离子易脱落，凝胶变软，甚至溶解，海藻酸钠单一载体固定化酶所得凝胶珠稳定性差。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：

（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在40℃～50℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在50～80℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=6.5～8.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2%～3%的海藻酸钠溶液；

（2）按体积比为0.5～2:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5～1h，加入胰蛋白酶液，搅拌0.5～1h，静置1～2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1～2；

（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为0.5%～1%的乙酸水溶液为溶剂，在50℃～80℃水浴下溶解0.5～1h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2～3的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl₂水溶液混合，搅拌10～20min，静置20～40min，获得CaCl₂-壳聚糖混合溶液；

（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl₂-壳聚糖混合溶液中，硬化成球0.5～1.5h，过滤，水洗3～5次，40～50℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；

（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为75%～90%的乙醇水溶液中，于50～60℃水浴10～15min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为2.5～3.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.0～9.0，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在50～60℃下，反应20min～1h，过滤，将滤液调节pH为8.0～9.0，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:0.5～2。

所述步骤（1）优选为：用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在45℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在60℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2.5%的海藻酸钠溶液。

所述步骤（2）优选为：按体积比为1:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌1h，加入胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1.5。