[发明专利]轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotaviras)，是人畜共患重要病原之一，可感染多种动物。猪的轮状病毒(porcine rotavirus，RV)感染最常见于仔猪，1-4周龄仔猪发病率超过80%，死亡率7%-20%。患猪主要表现为严重腹泻，排水样粪便，呈黄色到白色，含不同程度的絮状物，部分病例因严重脱水、酸碱平衡失调、继发感染而死亡。

目前轮状病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。

近年来，一种新型核酸扩增技术一环介导等温扩增(LAMP)技术，由于其快速、简单、特异等特点，越来越多运用于疫病诊断。LAMP技术是T．Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶基因6个特定区域及一种具有链置换特性的DNA聚合酶在等温条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶基因。该技术可用于微生物的快速检测，已广泛应用于食品、农业、卫生等领域。近年来，LAMP技术在动物疫病诊断方面发展迅速，已开发出猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等LAMP检测方法，但目前尚未见有检测猪轮状病毒LAMP检测技术的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及基于该环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，利用该检测试剂盒可以特异性的检测轮状病毒(rotavirus)。

本发明轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组，其由下列引物组成；

上游引物F3：5′-ACCATTCCTTAACGCACAA-3′（SEQ ID NO.1）；

下游引物B3：5′-GGCAACATCAGCATAGTCTT-3′（SEQ ID NO.2）；

上游内引物FIP：5′-

CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3′（SEQ ID NO.3）；

下游内引物BIP：5′-CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3′（SEQ ID NO.4）。

本发明轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组是根据猪轮状病毒VP4基因中较为保守的六个序列片段设计的两个特异性内引物(上游引物和下游引物)和两个特异性外引物(上游内引物和下游内引物)，该保守基因序列为猪轮状病毒所共有的，以保证基于该轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒检测不同来源的猪轮状病毒的可靠性。

基于上述的轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，其包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂和环介导等温扩增反应试剂和显色试剂，所述环介导等温扩增反应试剂包括环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶，所述环介导等温扩增反应液由以下的组分组成：10μmol/L的上游引物F3、10μmol/L的下游引物B3、10μmol/L的上游内引物FIP、10μmol/L的下游内引物BIP、5mol/L Betaine、100mmol/L MgS0₄、1.6mmol/L dNTPs、10×Thermo pol反应缓冲液。

所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

1）样品病毒RNA的提取；

2）将步骤1提取的病毒RNA逆转录成cDNA；

3）先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65℃等温条件下保温30-60min完成cDNA扩增反应；