[发明专利]一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于，步骤包括：

一、产硫酸软骨素酶的微生物初筛：用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10^-5，取稀释液0.2ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化1～2次，得到纯菌落，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，30℃温箱中培养4-7天后，向平板中倒入5ml 2mol/L的冰醋酸，浸泡5min，观察透明圈的有无，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用；

二、产硫酸软骨素酶的微生物复筛：将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，30℃，130r/min振荡通气培养48h，将菌液梯度稀释至10^-9，取0.2ml 10^-7、10^-8、10^-9的菌液，涂布于初筛培养基中，并使每个平板中培养基的厚度相同，30℃温箱中培养4-7天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，30℃、130r/min振荡通气培养24h，经平板菌落计数得菌体密度为2×10⁷～3×10⁷个/ml作为种子菌液，用于菌种鉴定和发酵培养；

三、菌种鉴定：运用形态特征鉴定和16SrDNA扩增与比对方法对步骤二得到的微生物菌种进行鉴定；

四、产硫酸软骨素酶的微生物发酵：按1.5-2.5% v/v接种量将种子菌液接入5L发酵罐中通过发酵培养基发酵，25-30℃，发酵60-72h；

五、发酵后硫酸软骨素酶提取：将步骤四所得发酵液置于离心机中，4℃、4000r/min离心30min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置24h,然后4℃、4000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中利用三蒸水对蛋白沉淀透析脱盐，在(NH₄)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄^2-的情况下，将透析液冷冻干燥即得硫酸软骨素酶粉。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤一中使用的培养基包括硫酸软骨素 0.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、Albumin bovine V 1%、琼脂2%，pH=7.0。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤二中使用的培养基包括硫酸软骨素0.5%、MgSO₄·7H₂0 0.5%、KH₂PO₄ 0.03%、NaCl 0.5%、冰醋酸0.5-1%、酵母浸粉1%，pH=7.0。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于，所述步骤四中选用的发酵培养基包括硫酸软骨素0.8%、MgSO₄·7H₂0 0.8%、酵母浸粉0.6%、KH₂PO₄ 0.02%、起始pH=6.0。

5.根据权利要求1所述的微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于：所述步骤三中形态特征鉴定是指将目标菌株在固体平板培养基上培养3～4d后，用肉眼观察菌落的形态特征；16SrDNA扩增与比对是指用煮沸法提取基因组DNA，扩增16S rRNA 基因序列及比对，电泳检测，基因测序，NCBI比对序列。