[发明专利]一种高纯度替考拉宁的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程领域，具体地说，涉及一种微生物发酵所得替考拉宁的分离纯化方法。

背景技术

替考拉宁（Teicoplanin）是游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）发酵产生的一种抗生素，其对革兰阳性需氧菌和厌氧菌具有较强的抗菌活性，是目前临床上为数不多的对多重耐药性金葡菌和肠球菌仍有抗菌活性的药物之一。

替考拉宁的分子量约为1900，是由结构十分相近的5个主要活性组分A_2-1、A_2-2、A_2-3、A_2-4、A_2-5，以及另外一个活性组分A_3-1组成。其中，前5个活性组分的总和简称A₂组，另一个活性组分称为A₃组。替考拉宁分子结构通式见式（1），其中，各活性组分取代基结构见表1。

表1

目前，制药领域遵循的标准中，《欧洲药典》（EP）对替考拉宁中A2组中各组分的比例有明确要求。临床研究表明，符合该比例要求的替考拉宁更加安全有效。现有替考拉宁的制备技术，通常是将生物发酵液经大孔树脂吸附浓缩后，结晶得到替考拉宁粗品，再通过纯化处理得到成品。然而现有的纯化处理方法通常难以获得符合EP标准的替考拉宁产品。中国专利申请201210221636.X公开了一种利用纳米聚合物微球制备替考拉宁精粉的方法，该方法部分实现了产品中单组份的含量可控。然而，由于纳米聚合物微球生产成本较高，该方法难以大规模推广，不适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉、适合工业化生产的替考拉宁的分离纯化方法，该方法所得产品纯度高、产品质量符合EP标准。

为实现本发明目的，本发明提供了下述替考拉宁的分离纯化方法，其步骤如下：

a、将替考拉宁粗品用纯化水溶解至替考拉宁浓度为5000-20000ug/ml，调节pH至7-9，通入装填有三氧化二铝的色谱柱进行上样吸附，然后水洗至流出液呈无色，再采用体积比浓度为5-30%的低元醇水溶液进行醇洗，然后水洗至流出液呈无色，再采用体积比浓度为40-90%的低元醇水溶液进行洗脱，收集洗脱流出液；

b、将洗脱流出液纳滤浓缩至替考拉宁浓度为5-20万u/mL，得到浓缩液；

c、将浓缩液用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至7.2-8.0，向其中加入脱色介质，使脱色介质的质量体积比浓度达到2-5%，搅拌30-120min，过滤得到脱色液；

d、脱色液经微孔滤膜过滤后，得到精滤液；

e、在搅拌状态下，向精滤液中加入低元醇，溶析结晶，抽滤，所得固体经真空加热干燥得到替考拉宁精粉。

本发明步骤a所述装填有三氧化二铝的色谱柱，其中三氧化二铝的粒度最好为200～300目；所述低元醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的任意一种，所述收集洗脱流出液，其具体操作方法是：测定洗脱流出液中A₂组各组分及杂质浓度，在A_2-1浓度达到峰值之前，当杂质占总溶质的质量分数＜15%时，开始收集，在A_2-5浓度达到峰值之后，当杂质占总溶质的质量分数＞2%时，停止收集。该部分流出液外观呈无色或接近无色。

本发明步骤b所述纳滤浓缩，最好采用截留分子量为100-800Da的有机纳滤膜。

本发明步骤c所述脱色介质可以是针用活性炭、糖用活性炭中的任意一种或两种的混合物，优选针用活性炭与糖用活性炭的混合物。

本发明步骤d所述微孔滤膜最好为F型聚偏氟乙烯微孔滤膜，其孔径为0.22微米或0.45微米。

本发明步骤e所述低元醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的任意一种，低元醇加入量最好为精滤液体积的3-15倍。

本发明步骤a所述上样吸附，流速最好为0.3-0.6BV/h，以流出液中替考拉宁的浓度大于100u/ml为止；所述醇洗，流速最好为1-2BV/h，以流出液达到3-4BV为止；所述洗脱，流速最好为0.3-0.6BV/h。