[发明专利]番茄植物干细胞分离培养提取与口服液、饮料和白酒的制备方法

权利要求书

本发明番茄植物干细胞分离培养提取与口服液、饮料和白酒的制备方法：

1.离体材料的制备

(1)优选无化肥农药污染，纯农家肥栽培的番茄，外皮已呈红色，内心尚未熟透，表皮无划伤的番茄果实，用水冲洗表面附着物，放进120mg/L的L-抗坏血酸液中浸泡1分钟，然后在放进1％升的苯菌灵溶液中杀菌10分钟，用无菌水冲洗10分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，用无菌水冲洗在放入30％升的过氧化氢液中杀菌10分钟，然后在用无菌水冲洗10分钟。

2.优选固态培养基的制备方法：

(1)硝酸钾2500mg/L，硫酸镁122mg/L，硫酸锰11mg/L，硫酸锌2.5mg/L，硫酸铜0.025mg/L，硫酸胺135mg/L。氯化钙112mg/L，碘化钾0.7mg/L，氯化钴0.025mg/L，磷酸二氢钠132mg/L，硼酸2.6mg/L，钼酸钠0.23mg/L，烟酸2.0mg/L，吡哆醇2.1mg/L，L-抗坏血酸53mg/L，柠檬酸78mg/L，L-天冬氨酸140mg/L，L-精氨酸180mg/L，甘氨酸75mg/L，脯氨酸120mg/L。a-萘乙酸2.2mg。蔗糖10.200mg/L。活性炭500mg/L。琼脂3800mg/L。磁化水0.7升。

(2)将无机盐各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌水中稀释，将氨基酸全部放入50ml无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释。然后将无机盐类各分别注入烧瓶中0.7升磁化水中，边加入边搅拌，在将蔗糖、固化剂、活性炭放内、进入高压灭菌30分钟，降温后取出，在将维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝。

3.离体材料诱导及形成层分离培养

(1)将灭菌的番茄果实用接种刀切成八段，将最外层薄皮去掉，去掉内心，，将外皮的内皮层取出放进固态培养基中，在受控暗室内培养26天，培养温度25±℃。

(2)将形成层细胞系用接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，在放大培养20天。

(3)然后将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室内用摇床旋转培养，在160rpm、25±℃环境中培养，传代时间设定为20天。

4.优选液态培养基的制备方法

按表1固态培养基的制备方法制作：

硫酸钾995mg/L，磷酸氢钾160mg/L，硫酸镁185mg/L，硫酸锌9mg/L，硫酸锰22mg/L，硫酸铜0.25mg/L，氯化钙70mg/L，硝酸钙480mg/L，钼酸钠0.26mg/L，硼酸6.5mg/L，硝酸胺420mg/L，乙二胺四乙酸铁钠盐38mg/L，肌醇230mg/L，硫胺素22mg/L，烟酸2mg/L，吡哆醇2.5mg/L，L-抗坏血酸65mg/L，柠檬酸72mg/L，L-天冬氨酸140mg/L，L-精氨酸180mg/L，甘氨酸80mg/L，脯氨酸120mg/L，a-萘乙酸2.2mg/L。蔗糖31000mg/L。麦饭石颗粒60000mg/L，锗石颗粒60000mg/L，硒矿石颗粒主90000mg/L。磁化水0.7升。

5.生物反应器内放大培养

将烧瓶内悬浮培养20天的细胞群移入20升的生物反应器内放大培养，培养基用优选液态培养基培养10天后，在向内注入蔗糖10g和甲基茱莉酮酸酯5mg、无菌磁化水0.5升的混合液，在继续培养10天。

6.细胞系培养物的提取分离方法

(1)将培养液用1um过滤器过滤，去掉培养液，将截留的粘胶状细胞系培养物取出，放入零下30度的冰箱内预冻3小时后，在放入液氮罐内超低温速冻2小时，取出解冻30分钟后，放入冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍。

(2)将冷冻2次的细胞系黏液质取出，在室温下维持10分钟后，高速粉碎成60目冻粉，之后放入75％的3000ml乙醇液中间接加温26℃中低温下用旋转式真空蒸发器浓缩，同时收集乙醇。

(3)将浓缩物放进低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥，待含水分低于3％以下时取出，高速粉碎100目，装入铝泊袋内真空封口，即成为番茄植物干细胞乙醇提取物。

7.番茄植物干细胞口服液，饮料和白酒的制备方法

(1)番茄植物干细胞粉1g，虫草多糖(含量为)3g，枸杞子多糖(含量40％)6g，葛根黄酮(含量为40％)1g，超氧化物歧化酶(SOD)0.1g，蜂胶65ml，L-抗坏血酸0.05g，苯甲酸钠0.02g，磁化水30ml。

将上述除蜂胶外，全部放入30ml磁化水中，进行超声粉碎混溶液中的细胞质20分钟，按常规法制成100ml的口服液剂型，每支10ml。

(2)饮料：

番茄植物干细胞粉0.05g，枸杞子多糖(含量40％)0.3g，柠檬酸0.2g，L-抗坏血酸0.01g，苯甲酸钠0.01g，磁化水380ml。

将上述各物质放入380ml磁化水中，搅拌溶解后，放入40HZ的超声波清洗机内，超声粉碎细胞质20分钟，然后按常规法制成380ml装的易拉罐剂型。

(3)番茄植物干细胞酒：

番茄干细胞粉1g，枸杞子多糖(含量40％)5g，优质白酒38°/500ml。

将干细胞粉，枸杞子多糖放入白酒搅拌溶解后，在放入40HZ超声波清洗机内超声粉碎乙醇混合物细胞质20分钟，按常规法过滤3um，制成500ml或不同剂量装的酒瓶内。