[发明专利]一种头孢菌素C高产菌株选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌株选育领域，尤其是一种头孢菌素C菌株的选育方法。

背景技术

头孢菌素C是一种重要的医药中间体，经过化学法或者酶法裂解为重要的头孢类抗生素母核——7-氨基头孢烷酸(即7-ACA)，其可以合成一系列毒性小、应用效果好的头孢菌素类产品，如头孢曲松钠、头孢克肟、头孢呋辛、头孢孟多等。现在半合成头孢菌素类已经发展到了第四代，临床需求量大，有巨大的市场空间。

头孢菌素C是由顶头孢霉等微生物通过发酵产生，该菌最早于1945年被分离，发酵水平由最初的10ug/mL提高到了40000ug/mL以上，提高了4000多倍，这离不开菌种选育工作者的辛勤工作。头孢菌素C菌种的选育方法包括传统方法和分子生物学方法。传统方法中的紫外诱变、微波诱变、化学诱变剂(吖啶橙、亚硝基胍等)诱变等在头孢菌素C菌株选育中得到了广泛的应用，提高了发酵水平，但是随着菌株对传统诱变剂抗性的提高，效果越来越来差，影响了菌种的选育进程；分子生物学方法目的性强，效果较好，但是该方法操作复杂，花费较高，在发酵生产过程中导入的基因容易丢失，影响到发酵产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、高效的代谢调控选育菌株的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种头孢菌素C高产菌株选育方法，包括以下步骤：

1)取-80℃顶头孢霉冷冻菌丝，20～40℃快速解冻，以1～6.7％的接种量接种到种子培养基中，摇床振荡培养2～6天；

2)以1～33.3％的接种量接种到发酵培养基中，摇床振荡培养4～10天；

3)再以1～33.3％的接种量接种到发酵培养基中，摇床振荡培养4～10天，此过程重复7次；

4)从摇床上取下摇瓶，用生理盐水进行10倍系列梯度稀释，用红血球计数板计数，找到顶头孢霉节孢子数量在10⁶～10⁸的稀释度10^-4；

5)以步骤4的稀释度为中心，选取10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6共5个梯度菌悬液均匀涂布脂肪酶鉴定平板，每个梯度设置3个重复，将平板置于20～30℃温度下静置培养10～20天；

6)培养结束后将培养好的平板置于350nm紫外灯下，用牙签挑取荧光圈大小适中并且边界清晰的菌落，接种到正常平板上，于20～30℃温度下静置培养10～20天，制备1～2cm×4～6cm的菌苔；

7)将预先制备的头孢菌素C敏感菌平板培养基融化，待温度降至45℃左右时向其中接入终浓度为10⁸CFU/mL左右敏感菌，倾倒平板，凝固后备用；

8)用直径为5mm的打孔器在步骤6制备的菌苔上打孔，制备琼脂柱，用接种环挑取此琼脂柱接种到步骤7的平板上，置于30～40℃的温度下静置培养1～2天；

9)培养结束后，用游标卡尺量取抑菌圈直径，挑选直径大于35mm的菌株进行另一轮的平板复筛试验；

10)经过多轮次的平板复筛后，筛选出10个抑菌圈较大的菌株制备冷冻菌丝，按照步骤1和步骤2的方法进行摇瓶复筛，测出发酵培养结束后发酵液中头孢菌素C的含量，进行多次斜面传代、多批次的菌株遗传稳定性和生产性能试验，筛选出发酵水平最高的菌株1～2株。

所述的种子培养基的配方为：玉米浆3.0～5.0％，葡萄糖3.0～5.0％，蔗糖2.0～4.0％，碳酸钙0.2～1.0％，pH6～8。

所述的发酵培养基，其配方为：玉米浆3.0～5.0％，花生饼粉3.0～5.0％，蔗糖2.0～4.0％，硫酸钙0.2～1.0％，蛋白胨1.0～3.0％，硫酸铵1.0～2.0％，硫酸亚铁0.01～0.1％，碳酸钙0.2～0.5％，豆油5～20％，pH6～8。

所述的脂肪酶鉴定平板，其配方为：硫酸铵0.05～1.0％，磷酸二氢钾0.05～0.5％，硫酸钾0.1～0.5％，七水硫酸镁0.01～0.2％，橄榄油1.0～4.0％，罗丹明B0.01～0.03％，聚乙烯醇0.01～0.3％，琼脂1.0～2.0％，pH6～8。

所述的头孢菌素C敏感菌平板培养基，其配方为：酵母膏0.1～1.5％，蛋白胨0.5～3.0％，氯化钠0.1～1.5％，琼脂1.0～2.0％，pH6～8。