[发明专利]一种酶底物法制备大肠杆菌群快速检测试纸

说明书

技术领域

本发明涉及快速检测大肠杆菌群的显色试纸，该试纸主要用于饮用水、肉食品、奶制品、蔬菜等的大肠杆菌污染的快速定性检测鉴定。

背景技术

目前用于大肠杆菌的检测方法主要指传统检测方法和快速检测方法，传统检测方法包括多管发酵法和滤膜法等，多管发酵法适用于各种样品，滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，但是这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。大肠杆菌的快速检测，则主要包括聚合酶链式反应技术、免疫分析法、电化学方法、荧光法等，缺点是不但需要专门的设备和仪器，还需要专门的技术人员，不利于现场检测操作。商品化的快速检测方法包括特异性检验的培养基、检测试纸片等。一般是利用大肠杆菌特异性酶检测鉴定大肠杆菌,大约96-98%的大肠杆菌产生β-D-半乳糖苷酶,而绝大部分沙门氏菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生该酶,因此利用该酶底物有效检测大肠杆菌,也都在24小时以上，还需要温箱培养等。

本发明利用大肠杆菌特异性酶与底物反应显色的特性与液体在滤纸上扩散的原理，用酶诱导物诱导大肠杆菌大量产酶，并确定了酶与底物的最佳反应条件，制作了能在5h内就出结果的检测试纸，一经使用，深受同行的认可，具有广阔的市场销售前景。

发明内容

本发明的目的在于：采用本检测试纸，快速检测来源水与食品的大肠杆菌群，试纸的制作工艺简单，成本低廉，直接显色，可肉眼快速判断。

本发明的目的是这样实现的：一种酶底物法制备大肠杆菌群快速检测试纸，分步骤；

步骤1试纸裁剪：

试纸C由长3-5cm、宽0.9-1.2cm的Whatman滤纸制得；

步骤2使用方法:

1)样品或样本做增菌处理：在9mL营养肉汤增菌液中加入1.0mL无菌生理盐水处理的样液，再加入0.5%的乳糖1.0mL，用以诱导β-D半乳糖苷酶的产生，培养4-6h，用于检测；

2)试纸处置；将浓度为4mg/ml、pH为6.5的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷溶液滴加到滤纸的B区，做试纸C的底物；

3)将增菌液直接滴加到试纸的A区，当大肠杆菌存在时，在试纸的T区呈现蓝色。

本发明的技术方案与原理：大约96%～98%的大肠杆菌均能产生β-D-半乳糖苷酶(β-galactosidase),而绝大部分沙门氏菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生该酶,而且自然环境中一般不存在该酶,该酶能与氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）等发生化学反应生成有色物质,因此可利用这些底物有效检测大肠杆菌。本发明用Whatman滤纸做成检测试纸，X-gal在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，将含有大肠杆菌的增菌培养液滴加到试纸上时，经扩散后其中的酶与底物相遇发生特异性化学反应，会出现肉眼可见的蓝色产物，从而达到快速检测的目的。

本发明克服现有的检测方法操作繁杂，时间较长之不足，用诱导物诱导大肠杆菌增菌过程中大量产酶，并确定了底物与酶反应的最佳条件，只要在该试纸上滴加诱导增菌液，即样本必呈现颜色，判断其大肠菌群的存在，操作极其简单快捷，彰显技术进步。

附图说明

本发明结合附图作进一步说明。

附图为试纸制作及使用操作示意图；

图中:C-试纸(材质滤纸)、A-加样区、B-酶底物X-gal区、T-显色区；将底物滴加在C试纸的B区，增菌样滴加A区，蓝色呈现在T区。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例

1)按照相关要求采集被检样品样本，按国标要求做增菌,在9mL营养肉汤增菌液中加入1mL无菌生理盐水处理的样液，再加入1mL0.5%的乳糖，诱导β-D-半乳糖苷酶的大量产生,培养4h后用于检测；如图，将增菌液直接滴加到检测试纸C的A区，当大肠杆菌存在时，1h后在试纸C的T区，肉眼可见蓝色的物质。

2)将浓度为4mg/ml、pH为6.5的购自Sigma公司的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）蒸馏水液滴加到长4cm，宽1cm的Whatman滤纸的一端制作成检测试纸,如图,在试纸C的B区滴加X-gal，制作成检测试纸;其中以X-gal为底物，浓度为4mg/ml，pH为6.5，温度为25-40℃，反应时间为1h。