[发明专利]一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原OppA2

说明书

技术领域

本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备技术领域。具体涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的鉴定、蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗中的应用。

背景技术

现代蛋白质组学技术与传统免疫杂交方法相结合产生一门新兴的交叉学科——免疫蛋白质组学(Immunoproteomic)，并迅速地应用于人、动植物和微生物的免疫原性蛋白研究之中，是一个大规模筛选病原菌抗原强有力的工具。本研究通过双向电泳和Western blot技术对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)分泌蛋白质组进行分析，筛选出抗原性好、保护力强的抗原蛋白，以期为发展血清学诊断标记及新型亚单位疫苗的研发奠定坚实的基础。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是一种革兰氏阴性菌，常定居于猪的上呼吸道，是一种条件致病菌，能够导致猪的副猪嗜血杆菌病。在1910年首次报道该菌，因此该病又称为革拉瑟氏病Hps只感染猪，能够影响2周龄到4月龄的猪，发病常见于5～8周龄猪。发病率为10％～15％，严重时死亡率可达50％，给养猪业带来巨大损失，该病的主要特征为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎和脑膜炎。

oppA2(Oligopeptide permease ABC transporter membrane protein)，是一种依赖于H离子的转运子，属于ABC transporters家族，参与蛋白、肽段、代谢物、离子或电子的跨膜转运。特异性的蛋白与配体的互作对于细胞功能非常重要，大多数蛋白严格选择它们的配体。然而，寡肽结合蛋白(OppA)能够没有选择性的结合2-5个残疾的肽段。寡肽结合蛋白在可溶物和营养吸收、芽孢和生物膜形成、细胞壁寡肽再生、依赖于肽段的群体感应、宿主细胞粘附和许多其它的生物学过程方面起到重要作用。OppABCDF五种基因产物共同实现跨膜转运功能，oppA为周质结合蛋白，OppB和OppC高度疏水形成跨膜通道整合于膜上负责跨细胞内膜转运肽段，OppD和OppF为膜相关的胞内ATP酶。

本试验鉴定到具有免疫保护效果的oppA2蛋白，并对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗开发的候选抗原。

发明内容

本发明的目的是提供能够用于制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的候选抗原的蛋白及其编码基因。

本研究通过双向电泳和蛋白印迹法技术对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)分泌蛋白质组进行分析，筛选出抗原性好、保护力强的抗原蛋白，以期为发展血清学诊断标记及新型亚单位疫苗的研发奠定坚实的基础。

本发明鉴定到具有免疫保护效果的OppA2蛋白，并对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

为了实现本发明目的，本发明首先分离副猪嗜血杆菌的胞外分泌蛋白，然后通过双向电泳方法分离分泌蛋白质组，并将其转移至硝酸纤维素膜上，使用猪的康复血清进行western-blot杂交寻找具有免疫原性的蛋白，然后通过质谱鉴定技术对具有免疫原性的蛋白进行质谱鉴定，再对其编码基因进行克隆表达，将表达的蛋白纯化后，再进行免疫原性分析，同时进行小鼠的免疫保护试验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。

本发明同时保护一种制备OppA2蛋白的方法，所述方法包括培养含有OppA2蛋白编码序列的重组大肠杆菌，得到OppA2蛋白。所述制备OppA2蛋白的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

本发明的OppA2蛋白具有免疫保护活性。

本发明的OppA2蛋白可以应用于副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的制备。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的核酸，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3.重组载体，其包含根据2所述的核酸。

4.包含根据2所述的核酸或根据3所述的重组载体的细胞。

5.根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其用作副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。