[发明专利]一种从克氏瓶直接到生物反应器的细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种从克氏瓶直接到生物反应器的细胞培养方法。

背景技术

细胞培养作为组织培养中的一种技术，通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物，或者利用培养到一定数量的细胞进行生物产品的制备。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。而在细胞培养过程中，如何使细胞数量大量增殖，在这之前通过各种方法增加细胞培养的表面积，尽最大可能的增加细胞数量。常规细胞扩大培养为将细胞复苏后，在克氏瓶中进行培养，培养到一定数量的克氏瓶后，转入10L或15L细胞圆瓶培养，最后才将圆瓶培养的细胞进行更多数量的10L或15L细胞圆瓶增殖或转入到生物反应器中进行扩大培养。

在传统细胞培养增殖过程中，从克氏瓶培养数量的增加，再将3～5个克氏瓶中的细胞消化分散，转入到10L或15L细胞圆瓶培养，再将3～5个10L或15L圆瓶中的细胞消化分散，转入到生物反应器中，经历了多个操作环节，每个环节都有可能造成细胞的污染，从而影响细胞的扩大培养。为了减少细胞扩大培养过程中的污染，往往在细胞培养液中加入抗生素进行细菌污染的控制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种从克氏瓶直接到生物反应器的细胞培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种从克氏瓶直接到生物反应器的细胞培养方法，包括以下步骤：

A1、细胞的复苏；从液氮罐中取出冻存的细胞，置37℃水浴中融化，移入装有含血清培养基的克氏细胞培养瓶中，置37℃、5%CO₂培养箱中，培养24小时，换液一次，继续培养24～48小时，至细胞长成致密单层；

A2、克氏瓶内细胞的消化；去掉克氏细胞培养瓶中的细胞营养液，用0.25%的胰酶消化，细胞经过消化，通过计数，细胞数达5～8×10⁶个；

A3、从克氏瓶到生物反应器的培养；将消化分散的细胞通过管道转入到含灭菌微载体和营养液的生物反应器中，让细胞在生物反应器内的微载体表面生长；

A4、生物反应器内细胞的增殖；待细胞在微载体表面长成单层后，在生物反应器内加入0.25%的胰酶，消化分散微载体表面的细胞；通过管道加入微载体，使细胞在更多的微载体上生长，从而完成细胞在生物反应器内的增殖。

本发明将细胞直接从克氏瓶到生物反应器的培养技术则减少了污染危险，将细胞在克氏瓶中复苏，待其长成单层细胞，消化分散，直接转入到生物反应器中，在这种培养技术中，细胞的扩大培养减少了很多中间环节，从而使得污染的概率大大降低。细胞在生物反应器中的微载体上生长，长成单层布满整个载体，在生物反应器中将细胞进行消化分散，再通过管道加入微载体，继续细胞的扩大培养。因此，在此细胞的扩大培养过程中，不加入抗生素进行细菌污染控制，有利于细胞的健康增殖，无抗生素残留。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、细胞的复苏。从液氮罐中取出冻存的细胞，置37℃水浴中融化，移入装有含血清培养基的克氏细胞培养瓶中，置37℃、5%CO₂培养箱中，培养24小时，换液一次，继续培养24～48小时，至细胞长成致密单层。

2、克氏瓶内细胞的消化。去掉克氏瓶中的细胞营养液，用0.25%的胰酶消化，细胞经过消化，通过计数，细胞数达5～8×10⁶个。

3、从克氏瓶到生物反应器的培养。将消化分散的细胞通过管道转入到含灭菌微载体和营养液的生物反应器中，让细胞在生物反应器内的微载体表面生长，具体方法为，细胞在生物反应器内，加入2～3克微载体，营养液1L，通过在微载体表面的生长，细胞数达1～2×10⁶个/mL。

4、生物反应器内细胞的增殖。待细胞在微载体表面长成单层后，在生物反应器内加入0.25%的胰酶，消化分散微载体表面的细胞。通过管道加入微载体，使细胞在更多的微载体上生长，从而完成细胞在生物反应器内的增殖；具体为，消化分散微载体表面的细胞，通过管道加入灭菌的微载体10～12克，营养液3～5L，让细胞继续在微载体表面生长，总数可达3～6×10⁹个/mL。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。