[发明专利]一种具有免疫抑制活性的三萜类化合物的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种异臭椿型三萜类成分stellettin B的制备方法以及它作为免疫抑制剂在器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗方面的应用。 

背景技术

器官移植的排斥反应和自身免疫病的治疗是当前临床面临的难题之一，近年来虽有不少进展，但是目前可供应用的免疫抑制剂仍远远不能满足临床的需求。从天然产物中寻找新的免疫抑制剂，始终是新药开发的热点。据报道，国外目前已上市和在研的免疫抑制剂有5大类，其中很多为天然产物或来自天然原料的半合成产品。西罗莫司、麦考酚酸等药物的研制成功，表明继续寻找新作用机制及独特化学结构的免疫抑制药物仍有重要意义。目前，除少数中药复方和中药有效部位药物外，我国生产的免疫抑制药物几乎全是仿制药品。 

海绵所生存的海洋环境生物多样性非常丰富，各生物物种间对食物、空间的竞争十分激烈。但是长久以来人们发现，尽管海绵身处的环境如此恶劣，但它们却很少被鱼类或其它生物捕食。这一现象提示海绵中存在着能抵御外来侵略(捕食)的自我防卫体系。科学研究发现，海绵之所以不被其它生物捕食并得以进化生存至今，主要是由于这类生物能够代谢产生各种各样的次生代谢产物并利用这些化学物质来抵御外界生物的侵犯。从海绵中寻找有重要生物活性和药用前景的先导化合物，为获得全新结构的自主知识产权新药提供了宝贵的先导化合物。 

国内外研究人员已对世界不同水域的Jaspis属海绵中次生代谢产物进行了研究，从中分离得到特征性化合物为异臭椿型萜类(isomalabaricane terpenoids)成分，并开展了一系列的生物活性筛选研究。但是其活性研究的范围主要集中在抗肿瘤的生物活性，该类化合物的有关免疫抑制活性方面的研究至今未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供异臭椿型三萜stellettin B的制备方法，进一步的目的是提供该化合物在制备免疫抑制剂药物中的应用。 

本发明的异臭椿型三萜stellettin B的制备方法具体如下： 

(1)总提取物的制备 

将海绵jaspis stellifera粉碎，以海绵的质量8倍体积的95％乙醇冷浸提取24小时，过滤的滤渣再以海绵的质量的6倍体积的95％乙醇冷浸提取24小时，过滤的滤渣再以海 绵的质量6倍体积的95％乙醇冷浸提取24小时，合并三次提取的滤液，减压浓缩至浸膏状，得总提取物； 

(2)分离纯化 

将步骤(1)得到的总提取物用氯仿和水进行分配萃取，氯仿层萃取液经减压浓缩得到氯仿层萃取物。将氯仿层萃取物用硅胶(200-300目)柱层析，二氯甲烷∶乙酸乙酯梯度洗脱得多个馏分； 

将体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝4∶1的洗脱剂洗脱下来的组分用凝胶柱色谱sephadexLH-20(流动相为甲醇∶水＝4∶1)进行预处理，再经正相硅胶柱色谱(流动相为二氯甲烷∶丙酮＝20∶1)分离得到化合物stellettin B。 

Stellettin B经体外小鼠脾淋巴细胞转换活性筛选试验，显示出很强的活性，其EC₅₀值达到了14nM。 

因此，本发明为研制新的免疫抑制剂提供了先导化合物，有利于开发利用海洋药用资源。 

具体实施方式

以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。 

实施例1：stellettin B的制备 

将海绵jaspis stellifera(湿重5公斤)粉碎匀浆，用40升95％乙醇冷浸提取24小时，过滤的滤渣再用30升95％乙醇冷浸提取24小时，过滤的滤渣再用30升95％乙醇冷浸提取24小时，合并三次提取的滤液，减压浓缩至浸膏状，得总提取物162克； 

将总提取物用CHCl₂和H₂O进行分配萃取，CHCl₂层经减压浓缩得到CHCl₂层萃取物约53克。将CHCl₂层萃取物用正相硅胶(200-300目)进行柱层析粗分离，流动相为二氯甲烷∶乙酸乙酯梯度洗脱得15个馏分，标记为Fr.A～Fr.O； 

Fr.E先用凝胶柱色谱(甲醇∶水＝4∶1)进行预处理，得到8个组分，从E-4组分中经硅胶 

柱色谱(二氯甲烷∶丙酮＝20∶1)分离得到stellettin B(35mg)，为亮黄色棱状结晶。 

经核磁共振波谱仪检测分析确定了stellettin B的化学结构，它的理化性质和波谱数据为：