[发明专利]短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法

权利要求书

1.短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法是对保藏在中国典型培养物保藏中心的短稳杆菌（拉丁文学名为Empedobacter brevis，保藏编号CCTCC  NO：M 202046）GXW15-4进行野外驯化、提纯，使之保持较强杀虫活并成为能够用于工厂化生产的原种的方法，其特征在于：经野外驯化、提纯培育的菌种能够保持对高抗化学杀虫剂的蔬菜小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫致死效果在85%以上并能够用于短稳杆菌杀虫剂工厂化生产。

2.根据权利要求1所述的野外驯化短稳杆菌GXW15-4，其特征包括以下步骤：

（1）在晴天室外温度37⁰C以上的夏季烈日下，将短稳杆菌杀虫剂按常规用药方法喷施在有4龄以上小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫的田间植物体上，喷施在植物体上的短稳杆菌GXW15-4经白天紫外线照射后，让小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫在夜间捕食并经口进入其体内；

（2）选择药后1～2天死亡的小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫尸体，晒干备用；

（3）将干瘪的小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫尸体粉碎后均匀撒布于无菌琼脂培养皿中培养24小时，获得野外驯化1次、含有较高纯度的短稳杆菌GXW15-4混合物质；

（4）将获得的混合物质稀释，按照前（1）～（3）的步骤重复2次以上，获得野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质。

3.根据权利要求1所述的提纯短稳杆菌GXW15-4是根据短稳杆菌GXW15-4 特征采取非相同特征淘汰法获得杂菌率小于2%的短稳杆菌GXW15-4优良原种的方法，其特征包括以下步骤：

（1）提取野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质，用无菌水稀释并涂布接种在无菌的琼脂培养皿中，在37⁰C条件下培养24小时；

（2）在JSM-7001F扫描电镜下观察菌落，选择并挑取菌株呈黄色、短杆状、两端钝圆、边缘光滑完整的15个菌落，将菌落逐个稀释、涂布、接种在与菌落数相同的15个无菌琼脂培养皿中分别在37⁰C条件下培养24小时；

（3）将15个培养皿中的培养物分别用无菌水冲洗，形成15种菌液，再用移液器分别提取1ml，分别稀释至10^-5～10^-6，再分别取0.01ml于2cm²的载玻片上烤干后制成喷铂金载玻片，用JSM-700IF扫描电镜分析仪观察，将未出现约1μm³的正方体荧光色晶体的视为非短稳杆菌GXW15-4培养物，将提取该培养液的培养皿中的培养物淘汰之；

（4）将剩余的培养皿中的培养物分别取样、用革兰氏染色法染色，在油镜下观察，选择菌体被染成红色的阴性菌比率在98%以上的培养物作为原种用于短稳杆菌杀虫剂生产。