[发明专利]一种发酵培养海洋真菌生产抗癌化合物1403C的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工艺学技术领域，更具体地，涉及用于反应器发酵培养海洋真菌的生物工艺，特别是指一种用于搅拌式生物反应器发酵培养海洋红树林内生真菌(Halorosellinia sp.)高产抗癌化合物1403C的生产工艺。

背景技术

海洋生态系统按照生物群落划分，一般分为红树林生态系统、珊瑚礁生态系统和藻类生态系统等。红树林生态系统的微生物资源既丰富又不失特色，主要类群包括细菌、真菌、放线菌、微型藻类等，目前已分离鉴定的红树林真菌就已超过200种，成为海洋真菌的第二大类群。海洋真菌可以产生众多天然化合物，且大部分化合物结构新颖、活性独特，应用价值较高。

海洋红树林内生真菌No.1403属于盐生坚座壳种(Halorosellinia sp.)，由香港城市大学L.L.P.Vrijmoed教授从中国南海的红树树叶内部分离得到，经液体或固体发酵可产生多种有重要价值的代谢产物。1403C是其产生的一种蒽醌类次级代谢物，亦称SZ-685C，结构式如下式(I)，纯品为红色颗粒状结晶，分子式为C₁₆H₁₆O₈，分子量336Da。1403C及其乙酰化产物具有显著的抗肿瘤活性，对体外培养的人乳腺癌细胞有高效抑制作用，是一种潜在的抗癌候选药物。

(I)

然而，现有技术中，海洋红树林内生真菌在初始环境下1403C产量很低，而本领域又需要生产大量的1403C，因此有必要提高1403C的产量，为其大规模应用提供可能。

至此可知，海洋红树林内生真菌(No.1403)的发酵工艺优化工作是突破抗肿瘤抗癌药物极度匮乏之瓶颈的当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵培养海洋真菌生产抗癌化合物1403C的方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于提高海洋红树林内生真菌(Halorosellinia sp.)生产化合物1403C产量的方法，所述方法包括：将海洋红树林内生真菌种子液接种到发酵培养基中液体培养，每升培养基接种干重0.22±0.05g的菌体；和如下调节发酵培养基的pH值：发酵初始时调节培养基的pH6.2±0.4；之后当pH值低于3.8-4.2(选自3.8-4.2范围内的一个值)时，加入碱液避免pH进一步降低；待碳源耗尽后不再调节pH值。

在一个优选例中，pH采用如下调节策略：发酵初始时调节培养基的pH6.2±0.2；之后当pH值低于4.0-4.2(选自4.0-4.2范围内的一个值)时，加入碱液避免pH进一步降低；待碳源耗尽后不再调节pH值。

在另一优选例中，所述的海洋红树林内生真菌是海洋红树林内生真菌No.1403。

在另一优选例中，所述的发酵培养中，培养温度28±2℃。

在另一优选例中，发酵罐装液量是罐体容量的60-80%(较佳地为65-75%)；和/或发酵过程中维持发酵罐的罐内压力为0.01～0.04Mpa(较佳地为0.02～0.03Mpa)。

在另一优选例中，发酵罐中装备1-3层搅拌桨(如双层六平叶涡轮桨或三层组合搅拌桨)，搅拌转速80～500r/min(较佳地100-400r/min，搅拌转速以发酵罐体积而定)。

在另一优选例中，发酵罐中初始通气量为0.3-0.6vvm(较佳地0.4-0.5vvm)，发酵过程的最低溶氧不低于30%(即：发酵前期，尤其是生长期，当溶氧低于30%时，调节通气量避免溶氧进一步下降；发酵后期，通过通气与搅拌转速偶联控制，维持溶氧为30-40%；当高于30%时则不调节)。

在另一优选例中，发酵规模为5-1000L发酵罐发酵。

在另一优选例中，发酵规模为5-500L发酵罐发酵。

在另一优选例中，所述的碱液包括：NaOH溶液。

在另一优选例中，发酵时间为60-150小时；较佳地为70-120小时。

在另一优选例中，所述的发酵培养基含有：

(1)-(4)的组分溶于10-60%(v/v)浓度的人工海水中。

在另一优选例中，所述的人工海水含有：

(a)-(g)的组分溶于水中。

在另一优选例中，发酵培养基中，还加入按照体积0.3‰的消泡剂；较佳地，所述消泡剂是：聚醚改性硅油消泡剂。

在另一优选例中，用于接种的海洋红树林内生真菌为二级种子液，将一级种子液(见专利，申请号：201210067014.6)按照5%(v/v)接入相同种子培养基，发酵培养24～48h。